12份白花泡桐材料親緣關(guān)系的ISSR分析

鄭興華++鄭正練++丁慧++肖少華++覃子海

摘 要 以‘福桐、‘綠桐2個(gè)無性系與10個(gè)不同種源的白花泡桐個(gè)體為研究對(duì)象，采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)12份白花泡桐材料的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，并利用DPSv3.01進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明：10條引物共擴(kuò)增出66條條帶，其中有37條多態(tài)帶，多態(tài)性比例為56.1%。根據(jù)ISSR聚類分析結(jié)果，在遺傳距離為0.35時(shí)，12份白花泡桐材料可分為5類，第1類為‘福桐無性系與河南、河北種源個(gè)體；第2類為‘綠桐無性系與湖南、湖北、江蘇種源個(gè)體；第3類為浙江、廣東種源個(gè)體；第4類為江西、福建種源個(gè)體；第5類為廣西種源個(gè)體。此結(jié)果可確定‘福桐與‘綠桐為2個(gè)不同的無性系。

關(guān)鍵詞 白花泡桐 ；親緣關(guān)系 ；簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）

中圖分類號(hào) S792.43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.009

ISSR Analysis of Relationship of 12 Accessions of Paulownia fortunei

ZHENG Xinghua ZHENG Zhenglian DING Hui XIAO Shaohua QIN Zihai

（Guangxi Futong Forestry Science and Technology Co.， Ltd.， Nanning， Guangxi 530021）

Abstract The genetic relationship of 12 accessions of Paulownia fortunei including two clones‘Fu Tong， ‘Lv Tong clones and 10 individuals of different provenances was analyzed by ISSR data and clustered with DPSv3.01. The results showed that a total of 66 DNA bands were obtained， of which 37 bands were polymorphic and the percentage of polymorphic bands was 0.561. All these accessions could be divided into five groups by ISSR cluster analysis. The first group consisted of clone ‘Fu Tong and individuals of Henan and Hebei provenances； the second group included clone ‘Lv Tong and the individuals of Hunan， Hubei and Jiangsu provenances； the third group the individuals of Zhejiang and Guangdong provenances； the fourth group the individuals of Jiangxi and Fujian provenances； and the fifth group the individuals of Guangdong provenances. It is hence concluded that clones‘Fu Tong and ‘Lv Tong are different.

Keywords Paulownia fortunei ； genetic relationship ； inter-simple sequence repeat

泡桐（Paulownia）為中國(guó)最重要的速生優(yōu)質(zhì)用材和生態(tài)防護(hù)樹種之一，在中國(guó)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)方面一直發(fā)揮著不可替代的作用。中國(guó)泡桐種質(zhì)資源分布廣泛，種類豐富，僅大陸就有9種2變種和眾多變異類型[1]。白花泡桐（Paulownia fortunei）為玄參科（Scrophulariaceae）泡桐屬落葉喬木，高達(dá)20 m，在中國(guó)分布于10多個(gè)省（區(qū)）。具有耐鹽堿、抗性強(qiáng)、對(duì)氣候適應(yīng)范圍廣、生長(zhǎng)快、材質(zhì)優(yōu)異、生態(tài)價(jià)值高等特點(diǎn)，為中國(guó)中東部地區(qū)的重要速生造林樹種[2]，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

為開發(fā)利用泡桐資源，國(guó)家林業(yè)局專門成立了泡桐研究開發(fā)中心，收集泡桐優(yōu)良種質(zhì)資源，選育泡桐優(yōu)良無性系，在林分結(jié)構(gòu)、經(jīng)營(yíng)密度、干形培育等定向培育方面取得了較大進(jìn)展。同時(shí)以泡桐木材為基材，研發(fā)磁控濺射鍍膜木材技術(shù)，為泡桐木材的利用及增值奠定了基礎(chǔ)，有利于整個(gè)泡桐產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效。

除國(guó)家層面外，河南、江西、山東、貴州等省份也有泡桐研究及開發(fā)利用的相關(guān)報(bào)告。在廣西，目前主推的泡桐品種有‘福桐、‘綠桐等，但其來源地不甚清楚。為此，本研究開展研究摸清其來源，為其造林推廣提供參考信息。

ISSR（inter-simple sequence repeat）分子標(biāo)記是由zietkiewiez等提出的一種新型分子標(biāo)記，是在SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種通過半隨機(jī)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)，可用于檢測(cè)重復(fù)序列之間區(qū)域的DNA序列差異[3]。ISSR標(biāo)記結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，具有模板需要量少、多態(tài)性豐富、無需試劑盒、結(jié)果記錄方便、實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)[4]。自從發(fā)展ISSR標(biāo)記以來，ISSR已在遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、種群遺傳學(xué)、種質(zhì)資源、育種、種質(zhì)評(píng)估、分類學(xué)與種系發(fā)生學(xué)等方面得到了迅速應(yīng)用，是用于分析物種、種群、不同品系、個(gè)體間遺傳差異的理想方法，具有廣闊的應(yīng)用前景[5-8]。

本研究將利用ISSR標(biāo)記對(duì)‘福桐、‘綠桐無性系及10個(gè)種源的白花泡桐個(gè)體進(jìn)行鑒定及親緣關(guān)系分析，以期為泡桐的資源利用、品種鑒定及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

12份材料均為白花泡桐，采自廣西福桐林業(yè)科技有限公司種質(zhì)資源收集圃。材料的來源地分別為：江西、浙江、河南、福建、廣東、湖北、湖南、江蘇、河北、廣西等10個(gè)省（區(qū)），每個(gè)省（區(qū)）采集1個(gè)個(gè)體，實(shí)驗(yàn)的材料還包括綠桐公司的‘綠桐及廣西福桐林業(yè)科技有限公司的‘福桐2個(gè)無性系材料。供試材料見表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采集新鮮葉片，擦拭干凈后，置于自封袋內(nèi)，放入硅膠干燥處理。稱取0.1 g左右的干葉，用Fastprep（Bio101，USA）粉碎，以CTAB法提取每個(gè)樣本的總DNA[9-10]。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序

泡桐的ISSR反應(yīng)體系為：在25 μL的PCR體系中，包括1×Taq酶緩沖液，1.25 U Taq DNA聚合酶（天根），4種dNTP各0.2 mmol/L，0.4 μmol/L引物，2.0 mmol/L MgCl2，50 ng模板DNA。最佳PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，共38個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃保存5 min，最后4℃保存[11]。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖電泳，按照相同遷移位置上有擴(kuò)增條帶記為“1”、無擴(kuò)增條帶則記為“0”的方法記錄每個(gè)引物的電泳譜帶，將“0”、“1”數(shù)據(jù)輸入Excel表格中，采用UPGMA法，在DPSv3.01統(tǒng)計(jì)分析軟件中進(jìn)行聚類分析[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR條帶和多態(tài)性分析

從60對(duì)引物中篩選出10條帶型清晰、多態(tài)性好的引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，分別為：UBC807、UBC808、UBC809、UBC817、UBC825、UBC828、UBC830、UBC836、UBC846、UBC856。結(jié)果顯示：10條引物共擴(kuò)增到66條不同的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶有37條，多態(tài)性比例為56.1%；每條引物擴(kuò)增出的ISSR多態(tài)性條帶在4～12間，平均每條引物能擴(kuò)增出3.7條多態(tài)性條帶；擴(kuò)增片段大小在100～2 000 bp。引物UBC807、UBC830的電泳結(jié)果見圖1。

2.2 12份白花泡桐ISSR聚類分析

按Nei和Li（1979）的方法計(jì)算遺傳距離。結(jié)果表明，‘福桐無性系和河北種源的個(gè)體之間的遺傳距離最近，二者的遺傳距離為0.12。福建種源個(gè)體與‘福桐無性系的遺傳距離最遠(yuǎn)，它們之間的遺傳距離為0.739。‘綠桐無性系與湖南種源的個(gè)體之間的遺傳距離最近（遺傳距離為0.131），與江西種源的個(gè)體之間的遺傳距離最遠(yuǎn)（遺傳距離為0.565）。‘綠桐與湖南、湖北、江蘇種源的個(gè)體聚為一支，‘福桐與河南、河北種源的個(gè)體聚為一支。在遺傳距離為0.35時(shí)，12份白花泡桐材料可分為5類，第1類為‘福桐無性系與河南、河北種源個(gè)體；第2類為‘綠桐無性系與湖南、湖北、江蘇種源個(gè)體；第3類為浙江、廣東種源個(gè)體；第4類為江西、福建種源個(gè)體；第5類為廣西種源個(gè)體（圖2）。

3 討論

本研究中的試驗(yàn)材料有10個(gè)種源分別來自10個(gè)不同的省（區(qū)），另有2個(gè)未知來源地的無性系材料‘福桐和‘綠桐。結(jié)果表明，地理位置相近的種源個(gè)體之間的遺傳距離也相近，如湖南與湖北、河南與河北、江西與福建、及江西與廣西等。但也有少數(shù)例外，如浙江與廣東種源個(gè)體之間的遺傳距離小于浙江與福建種源個(gè)體之間的遺傳距離，這可能由以下2個(gè)原因造成：一是每個(gè)種源的取樣數(shù)只有1個(gè)，造成的試驗(yàn)或統(tǒng)計(jì)上的誤差，二是白花泡桐栽培歷史悠久，不同種源間的種苗存在相互調(diào)撥的情況。

‘福桐和‘綠桐無性系分別為廣西福桐林業(yè)科技有限公司和綠桐公司選育，近年來在廣西、廣東、福建、江西、貴州等省（區(qū)）大面積推廣。通過此研究，確定‘福桐及‘綠桐的來源地，有助于確定其最適宜的栽培及推廣區(qū)域。‘福桐和‘綠桐無性系間的遺傳距離為0.28，在遺傳距離為0.35時(shí)，‘福桐無性系與河南、河北種源個(gè)體聚為一支，‘綠桐無性系與湖南、湖北、江蘇種源的個(gè)體聚為另外一支。因此‘福桐和‘綠桐為不同的無性系，且來源地不同。

本研究結(jié)果為‘福桐和‘綠桐無性系的來源地提供了一定的信息，有利于指導(dǎo)其推廣種植。隨著白花泡桐扦插及組培技術(shù)的成熟[14-15]，白花泡桐的無性系造林得以實(shí)現(xiàn)，選用適宜的無性系進(jìn)行無性系造林將會(huì)進(jìn)一步提高白花泡桐林分的產(chǎn)量。

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① 收稿日期：2016-10-10；責(zé)任編輯/黃東杰；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 鄭興華（1969～），男，工程師，主要研究方向?yàn)榱謽I(yè)產(chǎn)業(yè)開發(fā)，E-mail： 525073088@qq.com。

③ 通訊作者：覃子海（1980～），男，高級(jí)工程師，主要研究方向?yàn)榱謽I(yè)生物技術(shù)應(yīng)用，E-mail： 75455621@qq.com。