雜交構樹開放式組培快繁技術研究

徐凱南++楊笑如

摘 要：本實驗通過添加不同溶度的次氯酸鈉溶液，與不加次氯酸鈉溶液作為空白對照，研究得出在保證不影響雜交構樹正常分化生長的前提下，雜交構樹誘導和擴繁培養基的最佳添加濃度均為10mg/L。在很大程度上解決了雜交構樹在開放式組培中的難題，為雜交構樹下在開放情況下創造了條件，簡化了操作環節，有利工廠化生產。

關鍵詞：雜交構樹；組織培養；快繁技術；開放式組織

雜交構樹是近年中科院極力推廣的一種優良速生樹種，是科學家通過傳統的雜交育種結合現代生物技術手段培育而得。具有抗逆性性強，耐干旱、貧瘠、鹽堿等優良特性，它的全身都是寶，葉、皮、果等都可以利用，有“未來軟黃金”的美稱。目前雜交構樹的種植主要通過插扦，但是插扦的成活率極低，選擇在較好的時間段，成活率高的雜交構樹嫩芽，配合生根粉進行插扦，成活率也只有24%[1]。而通過無菌操作組織培養不僅可以大大提高育苗的速度，使育苗不受季節限制，同時組培苗的生根率也高達100%。但污染和繁瑣的組培程序是阻礙組織培養走向工廠化的關鍵問題。開放式組培的研究具有重大的意義，它可以在不影響組培效果的前提下拋開無菌操作，簡化環節，降低成本，為植物組織培養及工廠化育苗提供新的可能。次氯酸鈉做為一種廣譜性抑菌劑，在組織培養細菌、真菌的污染與預防和香蕉開放式組培中都取得了不錯的效果[2]。本試驗采用抑菌劑次氯酸鈉，研究在不同濃度次氯酸鈉處理下對雜交構樹開放式組培生長的影響，以期簡化雜交構樹的組培程序，降低成本，為生產提供更好的服務。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用雜交構樹引種自中科構想（北京）林業科技有限公司 “中科1號”品系。采用的次氯酸鈉純度為分析純，由西隴化工股份有限公司生產，次氯酸鈉含量（以有效氯計）≥8.0%，游離堿含量（以氫氧化鈉計）≤5.0%，試驗用的次氯酸鈉溶液現配現用。其他藥品還有6-BA、NAA、KT、蔗糖等。

1.2 試驗方法

1.2.1 數據統計

污染率（%）=污染瓶數/總接種瓶數X100%

褐化率（%）=褐化瓶數/總接種瓶數X100%

存活率（%）=存活瓶數/總接種瓶數X100%

1.2.2 組培塑料杯滅菌處理

鑒于是開放式組培不需要經過高壓滅菌，本次實驗選取比較方便、易于運輸且透光性較好的塑料杯作為接種容器，封口采用奶茶封蓋機封口。塑料杯和封口膜使用前統一由外面的工廠用同位素鈷60照射消毒，備用。

1.2.3 次氯酸鈉最佳實驗濃度的實驗

誘導分化和增殖擴繁培養基的次氯酸鈉濃度均設置為0mg/L（為CK1，未經過高壓滅菌）、0mg/L（為CK2，經過121度，20min高壓滅菌處理）、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。接種方法采用開放式，對照組2在超凈工作臺接種。誘導分化每杯培養基接種2個 芽，每組10杯，處理3組。擴繁培養基每杯接種6個，每組20杯，處理3組。接種完之后30天觀察污染、褐化、存活情況，統計最后污染率、褐化率、存活率。

1.2.4 培養基的配制

配制培養基的房間需經過紫外燈30min照射消毒，誘導分化培養基采用MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+抑菌劑。增殖擴繁培養基采用MS+6BA 2.0mg/L+KT1.0mg/L +GA21.0mg/L+抑菌劑。培養基加熱溶解將PH值調到6.0后進行分裝，并迅速蓋好杯蓋，置于已經消毒干凈的接種室中冷卻凝固待用。

1.2.5 接種環境的營造

接種前一天晚上，打開紫外燈進行消毒，接種前關閉紫外燈，并進行75%酒精降塵處理。

1.2.6 培養環境的營造

培養室定時日光燈照射12h/d，設置溫度25±1℃，濕度保持在60%-80%，光照強度2000-3000LX。

1.2.7 開放式接種方法

不借助超凈工作臺，在已經消毒處理過的接種室內操作臺上，取氯化貢消毒后的構樹嫩芽于75%酒精擦拭后的接種盤上用剪刀剪去褐化損傷部分，每個接種芽留一個生長點，長度取2-3cm為宜。接種完一瓶后用酒精燈灼燒瓶口后迅速蓋上蓋子，完成接種。接種用的剪刀、鑷子和解剖刀每次使用后用75%酒精擦拭后置于300度消毒器中30秒后取出降溫待用。

2 結果與分析

2.1 誘導分化雜交構樹分化的最佳濃度

由圖1可得，從污染率來看隨著次氯酸鈉濃度的增加污染率不斷下降，在使用大于30mg/L次氯酸鈉的時候，污染率低于6.67%，相比較于其他處理組污染率低。從褐化率來看，隨著抑菌劑次氯酸鈉濃度的提高，褐化率呈不斷上升的趨勢，使用大于30mg/L次氯酸鈉的時候，所有的構樹嫩芽都死亡，一方面是因為雜交構樹屬于木本，本身會分泌多酚導致褐化，另一方面是受到太高濃度次氯酸鈉濃度的毒害。使用5mg/L和10mg/L次氯酸鈉濃度褐化率分別是36.67%和40.00%，褐化率與CK2相近。從存活率來看，隨著抑菌劑次氯酸鈉濃度的提高，存活率呈不斷下降的趨勢，高濃度的抑菌劑濃度（20mg/L-30mg/LNaClO），使得雜交構樹的嫩芽的存活率低于6.67%。從總體來看，30mg/L次氯酸鈉濃度時，污染率雖然很低，僅6.67%，但確呈現出高褐化率和低存活率。5mg/L和10mg/L的次氯酸鈉濃度雖然褐化率相差不大，但10mg/L次氯酸鈉濃度污染率和存活率相較于5mg/L時，呈現出更有利的一面，更有利于雜交構樹嫩芽的生長。所以次氯酸鈉做為雜交構樹嫩芽誘導分化的最佳濃度為10mg/L。

2.2 擴繁雜交構樹的最佳濃度

由圖2可得，從污染率來看，次氯酸鈉的濃度越高污染率越低。30mg/L次氯酸鈉濃度僅污染率僅5.00%比CK2處理組的還低。從褐化率來看，次氯酸鈉濃度的提高，褐化率呈上升趨勢，不利于雜交構樹的生長，30mg/L次氯酸鈉濃度下褐化率高達81.67%。從存活率來看，高濃度的次氯酸鈉也不利于構樹的存活，30mg/L次氯酸鈉濃度下存活率僅為6.67%。從整體來看，10mg/L次氯酸鈉處理組要優于其他處理組，存活率達71.67%。所以雜交構樹的擴繁培養基次氯酸鈉的最佳濃度為10mg/L。

3 討論

開放式組培的成功試驗目前還比較少看到有報道，傳統培養基的富營養化常常成為細菌的溫床，給開放式組培帶來困難，從優化培養基入手，在不影響正常生長的情況下，減少有機物和蔗糖的用量，即可以節約成本又有利于開放式組培的成功構建。近年來研究比較多的是從植物中提取某種具有抗菌的活性物質，在結合添加一點化學藥品，制成一種以植物原料為主的廣譜性抑菌劑[3]。由于研究一種有效的植物源廣譜性抑菌劑所需要的周期是比較長的，所以作者選擇使用次氯酸鈉作為雜交構樹開放式組培抑菌劑來研究。次氯酸鈉是含氯消毒劑使用最廣的，具有殺菌譜廣、作用迅速低毒、價格低，對真菌和芽孢也顯著的殺滅效果。

和常規的使用超凈工作臺進行接種工作相比，本試驗通過添加10mg/L次氯酸鈉建立的開放式組培可以有效的降低組培成本，首先脫離了超凈工作臺，就節省了超凈工作臺耗電費用，根據研究超凈工作臺耗電就直接占耗電成本的46%[4]，另一方面無菌操作變得沒那么嚴格，也從另一方面提高了工人接種效率[7]。而且添加了次氯酸鈉之后培養基就不用經過高壓鍋滅菌，不但節省了高壓鍋的滅菌費用，還提高了配制培養基的效率，還減少了對培養基中營養物質的破壞，更有利于植物的生長。誘導培養基加入10mg/L次氯酸鈉后，污染率、褐化率、存活率相比較于CK2差別都不是很大。擴繁培養基加入10mg/L次氯酸鈉后污染率和褐化率雖然和CK2還存在一點差距，但存活率也達到71.67%，筆者要指出的是本次試驗培養基所采用的是傳統培養基，沒有經過優化處理。如果培養基經達優化之后，構樹的組培效果是有可能達到和高壓滅菌同樣的效果，甚至有可能優于高壓滅菌的。

綜上所述：次氯酸鈉在雜交構樹開放式組培中的誘導和擴繁添加的最佳抑菌濃度均為10mg/L，而關于此濃度下是否適合生根培養及培養基如何優化有機物和碳源蔗糖的添加量的試驗還有待進一步研究。

參考文獻

[1]周鑫.不同處理方式對構插扦效果的影響[J].青海農林科技，2012（1）：8-11.

[2]解輝，莫廷輝，曾麗星.次氯酸鈉在香蕉開放式組織培養中的應用研究[J].熱帶作物，2011，32（5）：886-890.

[3]盧加舉，張正學，彭仕榮，等.復合型抑菌劑在甘蔗開放式組培中的應用研究[J].熱帶農業科學，2012，32（10）：67-71.

[4]高光林，孫英，唐立平.降低植物組培成本的技術研究進展[J].安徽農業科學，2010，38（16）：8296-8297，8302.

作者簡介：徐凱南（1990-），籍貫：福建安溪，學歷：本科，職稱：生物助理工程師，主要研究方向：林業種苗組培。