ING4基因在腫瘤細胞凋亡過程中的研究進展

張萌，伍季

(1.川北醫學院；2.南充市中心醫院泌尿外科，四川 南充 637000)

ING4基因在腫瘤細胞凋亡過程中的研究進展

張萌1，伍季2

(1.川北醫學院；2.南充市中心醫院泌尿外科，四川 南充 637000)

ING4(inhibitor of growth family member4)基因是近年來新發現的一種腫瘤抑制基因。作為抑癌基因家族的重要成員，其廣泛參與基因調節轉錄、細胞周期、凋亡、細胞衰老、接觸抑制、DNA修復、抑制血管生成、促進細胞自噬等多個過程，對腫瘤的進程和預后產生重要影響。腫瘤細胞的凋亡在腫瘤研究中處于熱點話題。ING4基因在腫瘤細胞凋亡過程中具有重要作用，它可以通過調節線粒體依賴性途徑和死亡受體途徑誘導細胞凋亡，還可以通過調節凋亡基因參與腫瘤細胞的凋亡。

ING4基因；腫瘤細胞；凋亡

生長抑制因子蛋白家族(inhibitor of growth family，ING)被確定為腫瘤抑制因子已有10多年，其共有5個家族成員，分別為INGl ～ ING5[1-3]。這5個家族成員廣泛參與基因調節轉錄、細胞周期、凋亡、細胞衰老、接觸抑制、DNA修復、抑制血管生成、細胞轉移、低氧等過程[4-5]。ING4 基因作為ING4家族中的重要組成成員，因其通過多種調節途徑在抑制腫瘤生長、浸潤、轉移以及促進細胞凋亡等過程中發揮著重要作用，從發現至今，一直處于熱點研究方向。眾多實驗表明ING4基因在許多腫瘤中如膠質瘤、乳腺癌、胃癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、頭頸部的鱗狀上皮細胞癌、惡性黑色素瘤、肝細胞癌等中起抑制作用[6]。本文就ING4 基因與腫瘤細胞凋亡過程中的研究進展作一綜述。

1 ING4基因

ING4基因為第二類腫瘤生長抑制因子家族的一員，是Shiseki[1]等在2003年發現并從人腦垂體中被分離出來。該基因定位于染色體12p13-31區域內，由8個外顯子和7個內含子組成，基因跨距13 kb，Genebank中有一個編碼248個氨基酸的mRNA轉錄本和一個編碼249個氨基酸的mRNA轉錄本，造成兩個轉錄本的不同的原因可能是由于ING4的不同剪切方式而形成。ING4基因編碼的蛋白定位于細胞核內，在人類所有被檢測到的組織中均有表達。

ING4基因編碼蛋白的N端和C端與ING家族其他蛋白具有高度同源性，其C端是具有高度保守的植物同源結構域(plant homeodomain，PHD)和核定位信號(nuclear localization signal，NIS)區[7]。PHD是廣泛存在于植物或動物的轉錄調節蛋白中的磷脂酰肌醇磷酸的核受體，通過與磷脂酰肌醇磷酸信號分子相結合能夠發揮調節細胞存活、細胞成熟、DNA修復、生長與增殖的作用。ING4蛋白通過PHD促進細胞凋亡的機制可能是：一方面是乙酰化組蛋白H4的多個賴氨酸殘基，從而改變染色體的空間結構；另一方面是PHD區與DNA或RNA結合則能起著調節轉錄的作用。ING4蛋白的NLS位于編碼氨基酸序列中段，含有127～167位氨基酸，具有多個含正電荷的賴氨酸，對ING4蛋白與p53在細胞核的復合定位中起著重要的作用。NLS不僅介導ING4的核定位以及IN4與p53在細胞核內的復合定位外[8]，而且在ING4與p53相互作用所誘導的p21表達上調中也扮演關鍵的角色。

隨著對ING4的研究進一步深入，越來越多的研究表明，ING4具有的功能包括增強p53的活性、維持細胞間的接觸性抑制、抑制腫瘤侵襲轉移、抑制低氧誘導因子的活性、參與組蛋白乙酰化作用、抑制腫瘤生長、抑制腫瘤新生血管的形成、影響細胞周期、促進細胞凋亡、促進細胞自噬及增強腫瘤對化療藥物的敏感性。

2 ING4與細胞凋亡的凋亡途徑

2.1 ING4與細胞凋亡的線粒體依賴性途徑

線粒體作為細胞器在細胞凋亡過程中發揮著重要作用，線粒體內外膜之間的通透性轉運孔(PT孔)的開啟，使其膜的通透性增加及跨膜電位降低，從而釋放細胞色素C、AIF、Smac和促凋亡因子等,并且細胞色素C能與Apaf-1及caspase-9形成復合體(凋亡小體)，在dATP、ATP存在下激活caspase-3，啟動caspase級聯，從而誘導細胞凋亡[9]。研究表明，Bcl-2家族蛋白質調節線粒體釋放的cyct及其它程序化死亡蛋白[10]，而Bcl-2家族又受ING4調節。

Li等[11]通過運用FCM和TUNEL凋亡技術分析U87MG細胞中ING4基因的凋亡機制，他們認為ING4首先上調Bax的表達，降低Bcl-2的表達，然后促進細胞色素C從線粒體的釋放，從而使caspase-3產生級聯反應。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose)polymerase，PRAP]作為caspase-3主要的剪切對象，可以被其剪切成2個片段：a85-和a31-kDa剪切產物。被剪切的PRAP失去了DNA修復的功能和保持基因完整性的作用，細胞走向凋亡。Li等[6]認為Bax打開了線粒體電壓依賴型陰離子通道，促凋亡基因Bcl-2可能參與了細胞色素C的釋放和caspase-3的激活，誘導了線粒體凋亡途徑。研究發現ING4基因在U-2OS細胞的過表達可以明顯提高mRNA的表達和Bax的蛋白水平，從而使caspase-3被激活以此促進細胞凋亡。

2.2 ING4與細胞凋亡的死亡受體途徑

死亡受體途徑是由于Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子TNF-ɑ、TNF相關誘導凋亡的配體(TRAIL)與其位于細胞離子膜上的同源死亡受體相結合，受體被激活并觸發引起凋亡蛋白的聚集，導致細胞凋亡，比如Fas相關死亡區域(Fas-associcted death domain protein，FADD)[12]。Fas屬于腫瘤壞死因子受體和神經生長因子受體超家族成員，它在分子結構上可以分為胞質區、跨膜區和膜外區。與之特異性相結合的天然配體(FasL)是屬腫瘤壞死因子配體超家族成員[13]。FasL通過與Fas的結合使Fas相關死亡區域蛋白聚集到Fas胞質區中的死亡結構區域(death domain DD)。憑借胱氨酸蛋白酶原(Prcaspase)-8轉變成活性caspase-8，使Prcaspase-8與FADD相結合從而形成死亡誘導信號復合體(the death-inducing signaling complex，DISC)，然后依次激活其他酶原如Prcaspase-3,6和7，最后導致細胞凋亡。另一方面，腫瘤細胞能夠逃避免疫系統的攻擊的重要機制之一就是通過Fas系統攻擊自然殺傷細胞和細胞性毒性T淋巴細胞從而使腫瘤細胞逃避免疫監視，最后抑制腫瘤細胞凋亡[14]。

Li等[15]通過構建慢病毒載體把ING4轉染至人類黑色素瘤A375細胞中發現ING4能夠上調Fas、caspase-8、caspase-3的表達，下調FasL的表達，其結果表明ING4可能增強以依賴caspase-8途徑的Fas系統誘導凋亡途徑從而導致惡性黑素瘤細胞凋亡，并且ING4在黑色素瘤細胞的低表達及其功能的丟失使FasL在腫瘤細胞中高表達，從而幫助黑色素瘤細胞逃脫免疫監視，進而誘導T淋巴細胞的凋亡以及導致Fas表達的下降使黑色素瘤避免T淋巴細胞的攻擊。Ling等[16]發現通過腺病毒把ING4轉染至SPCA-1人類非小細胞腺肺癌中，通過免疫組化實驗發現，Fas/FasL的表達上升。實驗者進一步發現ING4能夠增強Fas/FasL的表達，從而促進其下游分子如Caspase-8和Bid促凋亡蛋白的表達，最終激活凋亡的外源路徑。

3 ING4與細胞凋亡的基因調控

3.1 ING4與p53基因

p53蛋白質是一種由p53基因編碼的與細胞分裂周期相關的核磷酸蛋白質，分子量為53 ku。P53的重要功能是調節細胞周期和凋亡。它通過停止細胞生長和誘導細胞凋亡而發揮其腫瘤抑制的功能。ING4的羧基末端區域有能夠重構核染色質和調節轉錄的PHD結構，ING4蛋白的NLS轉錄的氨基酸蛋白位于其中段，參與p53活化后的四聚化、細胞內定位及對調節p53蛋白轉錄[17]。Guo等[18]通過HPV16 E6干擾ING4對p53的穩定作用而抑制宮頸癌細胞凋亡發現ING4基因能通過其自身的NLS結構域與p53結合，所以NLS區域不僅是ING4基因亞核定位區域，也是與p53相結合的必備條件。另外，ING4與p53能夠通過相互作用來增強p53蛋白活性和提高p53的甲基化[19]，如果改變ING4核定位或者NLS發生了突變，都會干擾ING4與p53的結合從而影響p53的功能[20]。ING4通過p53依賴途徑誘導細胞凋亡的的機制是：提高p53基因的甲基化抑制Mdm2介導的p53基因降解提高p53下游基因在轉錄及轉錄后水平的表達。

3.2 ING4與Caspase家族

Caspase家族是屬于半胱氨酸天冬氨酰特異性蛋白酶[21]。Caspase的激活在細胞凋亡發揮著主要作用。Caspase通常是由procaspase和非活性酶原形式存在。為了使細胞發生凋亡，procaspase必須被剪切或成為二聚體方能被活化。與凋亡有關的Caspase有兩類：起始者Caspases (initiator caspases)如Caspase2、8、9、10和執行者Caspases( effector caspases)如Caspases3、6、7[22]。Caspase家族在凋亡中的細胞外(死亡受體)途徑和胞內的線粒體途徑中扮演著重要的作用。在死亡受體途徑中，活化的受體經歷空間結構的改變和通過與procaspase-8的死亡效應區域(death effect domain，DED)相結合來募集initiator procaspase-8到胞內死亡區域。這個過程就形成了一個被稱為死亡誘導信號(DISC)的復合體。在DISC內，Caspase-8被剪切體所活化，然后觸發effector procaspase-3，從而誘導細胞凋亡。在線粒體途徑中，凋亡體的形成可以募集和活化initiator procaspase-9，由它剪切和活化effector procaspase-3，從而誘導細胞凋亡。所以在caspase家族中，caspase-3在誘導細胞凋亡過程中扮演者關鍵作用[23]。

Wu等[24]通過腺病毒把ING4轉染至人類MDA-MB-231 乳腺癌細胞中，他們發現ING4會使剪切的caspase-9和剪切的caspase-3的表達上調，從而證明ING4引起凋亡與caspases家族是有關聯的，并且他們認為活化的caspase-3引起細胞凋亡就可能表明ING4通過線粒體途徑腫瘤細胞的凋亡。同時ING4引起caspase-3的高表達可以使活化的caspase-3剪切apolymerase-1蛋白(PARP)2個片段：a 85-和a 31-KD剪切產物。然后被剪切的PARP就失去了DNA修復和保持基因完整性的能力，最終就不可避免地導致細胞凋亡。

3.3 ING4與Bcl-2家族

Bcl-2家族在抗細胞凋亡和促細胞凋亡中發揮著重要的作用。促進細胞存活的亞科包括Bcl-2,Bcl-XL,Bcl-w,Mcl-1,和A1，而促進細胞凋亡的亞科根據BH結構域所擁有的數量則被分為多結構域組(Bax、Bak和Bok)和BH-3單獨結構域組(Bid,Bim,Bad以及其它)。促進細胞存活的Bcl-2家族通過與多結構域的促細胞凋亡的Bcl-2家族成員相結合和抑制他們的凋亡活動，從而維持細胞的生存能力。這種相互的抑制作用是能夠被BH-3單獨結構域的成員所破解，BH-3單獨結構域的成員被細胞凋亡的信號所激活，然后多結構域促進凋亡的成員就攻擊線粒體，引起線粒體外膜的滲透性增加和凋亡。簡單來說，促細胞凋亡的多結構成員扮演促凋亡的“劊子手”，而促凋亡的成員和BH-3單獨結構域的成員分別扮演著凋亡的抑制作用和凋亡的啟動/效應作用[25]。

Wei等[26]通過把ING4轉染至MCF-7人類乳腺細胞癌中發現ING4基因的過表達可以使Bax的mRNA及蛋白水平相對上調。并且他們推測ING4與p53的結合不僅能調節轉錄活動而且可以調節p21和Bax的表達，同時認為Bax能夠誘導凋亡的原因是打開了線粒體電壓依賴型陰離子通道，從而導致細胞色素C的釋放以及其它來自線粒體的促凋亡因子，然后使caspase激活，最后產生內在性凋亡路徑。Cox-2作為前列腺素生物合成中的中心酶，對腫瘤的早期促進腫瘤細胞增殖，抗凋亡，血管增生，腫瘤細胞的浸潤，對腫瘤細胞擴散做準備都起了關鍵性作用[26]，并且Cox-2可以通過上調Bcl-2的表達而抑制凋亡。M?bius等[27]實驗發現，ING4轉染至U87膠質瘤中可以顯著降低Cox-2的表達，這就表明ING4促進凋亡可能下調Cox-2的合成，隨后下調Bcl-2的合成。

3.4 ING4與Survivin家族

Survivin是一種細胞凋亡抑制基因，其主要作用包括調節有絲分裂、維持細胞存活，并可在轉錄水平抑制p53依賴性凋亡。細胞質Survivin 高表達可使線粒體釋放的凋亡抑制蛋白抑制物失活，從而使放療誘發釋放的凋亡抑制蛋白抑制物不能發揮其有效作用，造成腫瘤細胞對放療等產生耐受。Survivin基因抑制細胞凋亡的主要機制通過抑制腫瘤細胞中的不同caspases的活性或與外源性和內源性的凋亡途徑的調節者相互作用以及或與細胞周期蛋白激活酶cdk34、p34和cdc2相互作用并敲除凋亡傳導信號從而發揮抑制細胞凋亡的作用[28-29]。

Mao等[30]同樣通過腺病毒把ING4轉染至多耐藥性SGC7901/CDDP胃癌細胞中，他們發現ING4可以下調Survivin的表達，從而引起腫瘤細胞的凋亡，并且在其缺少ING4的對照組中，Survivin mRNA的表達是上升的，所以在分子層面上，ING4是抑制Survivin的表達，從而促進凋亡的發生。同時這個研究結果，也在Wang等[31]把ING4通過腺病毒轉染至人類CNE鼻咽癌中也得到了相應的證明。

4 結語

隨著飲食、環境等的改變，腫瘤的發病率呈上升趨勢，而現有的治療方式對患者的生存率、治愈率的提高只在少數腫瘤中較為理想，如何尋找新的治療方法以及如何提高腫瘤的早期診斷是目前大多數學者的關注熱點。ING4 基因作為抑癌基因的重要成員，與腫瘤的關系十分密切，并且其在抑制凋亡過程的功能使其在惡性腫瘤的診斷及治療中得到重視。但就目前國內外文獻報道，ING4雖參與細胞凋亡途徑的過程，具有誘導細胞凋亡的生物功能，但是其具體機制仍不清楚。我們相信隨著對該基因研究的不斷深入，可以預見，ING4基因將為惡性腫瘤的診斷及治療帶來新的希望與機遇。

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(學術編輯：何朗)

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作者投稿系統：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

The research of ING4 gene in the progress of tumor cell apoptosis

ZHANG Meng1,WU Ji2

(1.NorthSichuanMedicalCollege;2.DepartmentofUrologicSurgery,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

Inhbitor of growth family 4(ING4) is a novel tumor suppressor reported recently.As an important member of anti-oncogene family,it was involved in regulation of gene transcription,cell growth regulation, cell apoptosis,suppression of loss of contact inhibition,DNA repair,angiogenesis, promoting cell autophagy,which have a significant impact on the progression and prognosis of tumor.The tumor cell apoptosis is a hot topic in the tumor research.ING4 plays a critical role in the process of tumor cell apoptosis,which can induce apoptosis by mitochondria independent way and death receptor way,and can participate in tumor celll apoptosis through regulating apoptotic gene.

Inhbitor of growth factor 4;Tumor cell;Apoptosis

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.041

四川省教育廳(13EA0226)

2016-05-1907

張萌(1989-)，男，碩士研究生。E-mail：1129057161@qq.com

伍季，E-mail：wuji2168@qq.com

時間：2017-3-6 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2109.082.html

1005-3697(2017)01-0143-04

R730.5

A