應用多重PCR技術快速篩查食品中的轉基因成分

董立明， 邢珍娟， 李蔥蔥， 夏 蔚， 閆 偉， 李飛武

應用多重PCR技術快速篩查食品中的轉基因成分

董立明， 邢珍娟， 李蔥蔥， 夏 蔚， 閆 偉， 李飛武*

（吉林省農業(yè)科學院，吉林 長春130033）

以轉基因植物中常見的3種篩選調控元件、2種標記基因和1種目的基因為檢測靶標，建立了能在一次PCR擴增中同時檢測6種轉基因成分的多重PCR檢測方法。結果表明，當多重PCR體系中CaMV35S啟動子、FaMV35S啟動子、NOS終止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的檢測引物濃度分別為0.2、0.2、0.3、0.3、0.2、0.2 μmol/L，退火溫度為60℃時擴增效果最佳，利用優(yōu)化后的六重PCR方法可從轉基因玉米、大豆、棉花、油菜等各類樣品中精準檢測出相應的轉基因成分，方法的檢測靈敏度可達到0.1%。該方法為食品中常見轉基因成分的篩查提供了一種高效的手段，在轉基因產品的檢測工作中具有較高的應用價值。

轉基因生物；調控元件；標記基因；目的基因；多重PCR；篩查

隨著轉基因技術在農業(yè)領域的推廣應用速度不斷加快，轉基因植物的品種日益豐富，1994~2014年間，全球65個國家和地區(qū)共批準了27種轉基因作物的357個轉化體的商業(yè)化應用，僅2014年全球就種植了1.81億公頃轉基因玉米、大豆、棉花、油菜等作物，越來越多的轉基因產品進入人們的生活

[1]。轉基因技術作為一項新興技術，在農業(yè)、醫(yī)藥、能源、環(huán)保、材料等多個領域發(fā)揮了非常重要的作用，但其打破物種基因隔離的優(yōu)勢也令公眾對其產品的安全性產生了質疑[2]，為此世界許多國家和地區(qū)相繼建立了轉基因產品標識制度，農產品中的轉基因成分已納入國內外檢疫檢驗部門的檢驗項目[3]。

日益增加的轉基因產品種類給轉基因產品檢測技術提出了更高的要求，精準、快速、高通量成為轉基因檢測技術發(fā)展的趨勢[4-5]。在經典的檢測技術中，PCR因其高特異性和高靈敏度一直是轉基因產品檢測方法研究的首選，以PCR技術為核心研制更快速、更高效的檢測方法是本領域近年來的研究熱點，將多對引物加入一個PCR反應體系中實現(xiàn)在單個反應管中一次性檢測多種轉基因成分的多重PCR方法已有諸多報道，Guo Jin-chao等利用簡并引物結合多重PCR建立了8種抗蟲和耐除草劑基因的四重PCR方法[6]，李飛武等建立了能同時檢測轉基因作物中的8種常見Bt基因的多重PCR方法[7]，魏霜等建立了檢測轉基因水稻中Cry1Ab基因、Gus基因、CaMV35S啟動子、NOS終止子等轉基因成分的七重PCR方法[8]。

在未知產品的轉基因成分檢測中，一般是先選擇最具代表性的少數(shù)幾個轉基因篩選元件進行篩查，若確認含有某種轉基因成分后，再進行進一步的身份鑒定[9]。因此，作者選擇轉基因植物中常見的6種轉基因成分 （CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS終止子、bar基因、CP4-EPSPS基因、NPTII基因）為檢測靶標，通過多重PCR擴增體系優(yōu)化、反應程序優(yōu)化、特異性檢測、靈敏度測試等試驗，建立了能同時檢測上述6種轉基因成分的六重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉基因玉米Bt11（ERM-BF412f）、Bt176（ERMBF411f）、MON810（ERM-BF413gk）、MON863（ERMBF416d）、轉基因大豆GTS40-3-2（ERM-BF410gk）等5種標準物質：購自歐洲標準物質與測量研究所；轉基因玉米MON89034（AOCS 0906-E）、轉基因大豆MON89788（AOCS 0906-B）、A2704-12（AOCS 0707-B6）、轉基因棉花LLCOTTON25（AOCS 0306-E2）、MON531 （AOCS 0804-C）、MON1445（AOCS 0804-B）、MON15985（AOCS 0804-D）、轉基因油菜GT73（AOCS 0304-B）等8種標準物質：購自美國油脂化學家協(xié)會；非轉基因玉米、大豆、棉花、油菜樣品：作者所在實驗室保存樣品。每種樣品中含有的轉基因檢測靶標信息詳見表1。

除了表1所列的試驗材料，作者還制備了一份含有全部6種檢測靶標的陽性對照樣品，包含轉基因玉米MON863、轉基因大豆MON89788和轉基因棉花LLCOTTON25等3個轉化體，每個轉化體的質量分數(shù)為5%，以非轉基因玉米、大豆、棉花、油菜的等量混合物作為填充物。

表1 試驗材料及含有的靶標轉基因成分信息Table 1 Description of the genetically modified components in the test materials

1.2 主要試劑和儀器

植物基因組DNA提取試劑盒：購自北京天根生物技術有限公司；多重PCR試劑盒（2×Multiplex PCR Assay Kit）、HS-Taq DNA聚合酶、DNA分子量標準：購自寶生物工程（大連）有限公司；GeneFinder核酸染料、瓊脂糖等購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；檢測引物委托上海生工生物公司進行合成和純化。

紫外/可見光分光光度計 （ND1000）：美國Thermo Fisher公司產品；梯度PCR儀（C1000）、凝膠成像系統(tǒng) （GelDOC XR+）：美國Bio-Rad公司產品；高速離心機（5424）：德國Eppendorf公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品基因組DNA提取 按照DNA提取試劑盒的說明書提取全部試驗材料的基因組DNA，用紫外/可見光分光光度計檢測DNA樣品的質量和濃度，用滅菌超純水將樣品DNA稀釋至25 ng/uL，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設計與篩選 通過查閱國內外數(shù)據(jù)庫、論文、標準等文獻，并結合多重PCR檢測引物設計與篩選的一般原則，使用Primer Premier 5.0軟件設計和分析確定6個檢測靶標的特異性PCR引物，引物信息詳見表2。所有引物用滅菌超純水稀釋至10 μmol/L備用。

表2 檢測引物信息Table 2 Information of the primers in this study

1.3.3 PCR擴增體系及程序 單一PCR檢測，總反應體系為25μL，包括：2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL dNTPs混合物 （10 mmol/L），0.5 μL正向引物（10 μmol/L），0.5 μL反向引物 （10 μmol/L），0.125 μL HS-Taq DNA聚合酶（5 U/μL），2 μL DNA樣品（25 ng/uL），17.375 μL滅菌超純水。

六重PCR檢測，總反應體系為50 μL，包括：25 μL 2×Multiplex PCR Assay Kit（含緩沖液、dNTPs、Mg2+等），14 μL引物預混液 （CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的正反向引物各1 μL，NOS終止子、bar基因的正反引物各1.5 μL），4 μL DNA樣品，7 μL滅菌超純水。

單一和六重PCR擴增程序：95℃預變性 5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)；72℃延伸5 min。

PCR結束后，取7.5 μL的PCR擴增產物用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

2 結果與討論

2.1 檢測引物適用性測試

作者選擇的6種檢測靶標的單一PCR方法均已建立了相應的國家標準，但由于擴增產物大小集中于180~333 bp，將這些方法的引物直接應用到多重PCR體系中難以區(qū)分每一種靶標轉基因成分。為此，在系統(tǒng)分析各個檢測靶標的序列信息及現(xiàn)有方法基礎上，針對FMV35S啟動子和NPTII基因重新設計了PCR檢測引物，并對新設計的這2對PCR引物的特異性進行了驗證。驗證樣品包括陽性對照樣品和轉基因玉米 Bt176、MON810、MON863、MON89034、轉基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、 轉 基 因 棉 花 MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、轉基因油菜GT73、非轉基因植物混合物等13種植物樣品。結果顯示，利用設計的FMV35S啟動子引物能夠從陽性對照樣品、MON89034玉米、MON89788大豆、MON1445棉花和GT73油菜樣品中擴增出401 bp的特異性片段，利用 NPTII基因引物則能從陽性對照樣品、MON863玉米、MON531棉花、MON1445棉花和MON15985棉花樣品中獲得499 bp的特異性擴增產物，均與預期結果一致（見圖1和表1）。由此確定了6個檢測靶標的擴增引物，不同擴增產物之間至少相差60 bp，從理論上確保多重PCR產物可通過3%的瓊脂糖凝膠電泳進行區(qū)分。

圖1 FMV35S啟動子和NPTII基因檢測引物的特異性測試Fig.1 Specificity of the primers for FMV35S promoter and NPTII gene

為進一步驗證篩選出的6對檢測引物（表2）在單一PCR和多重PCR中的適用性，以非轉基因植物混合物的DNA樣品為稀釋劑，將陽性對照樣品DNA溶液稀釋至每個轉化體組分質量分數(shù)均為1%，進行單一PCR和多重PCR測試。結果如圖2所示，以6對引物分別進行單一PCR擴增時，均能從陽性對照樣品中特異性地擴增出對應的轉基因成分，而將6對引物放在同一PCR管中進行六重PCR擴增時，可從陽性對照樣品中擴增到6種預期的轉基因成分，且在電泳圖譜中能夠清晰識別出每一種檢測靶標的特異性條帶，表明這6對引物適用于構建多重PCR檢測體系。

圖2 引物適用性測試Fig.2 Applicability of the primers forsingletand multiplex PCR assays

2.2 六重PCR的擴增體系和反應程序優(yōu)化

由于每種轉基因成分檢測引物的擴增效率和退火溫度不盡相同，為保證每對引物在多重PCR體系中均能正常工作，盡可能降低引物間的交互抑制，并確保建立的多重PCR方法滿足一定的檢測靈敏度，需對每種檢測靶標的引物用量和退火溫度進行梯度測試[12]。為此，將陽性對照樣品DNA用非轉基因植物混合物的DNA稀釋成每個轉化體組分分別為質量分數(shù) 1%和 0.1%的測試樣品，設置CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS終止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的引物終濃度比為0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.25∶0.25∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.3∶0.3∶0.2∶0.2等3種組合，退火溫度為58、60、62℃等3個梯度。結果顯示，當引物濃度比為0.2∶0.2∶0.3∶0.3∶0.2∶0.2，退火溫度為60℃時，6個基因都能得到很好的擴增，且電泳條帶清晰可辨，優(yōu)于其他組合（圖3），由此確定了如1.3.3所述的六重PCR的最適反應體系和程序，用于進一步的測試。

2.3 六重PCR方法的特異性測試

用非轉基因植物混合物的DNA樣品作為稀釋劑，分別將13種轉基因植物的DNA樣品稀釋至轉化體質量分數(shù)均為1%。以稀釋后的DNA樣品作為模板，用優(yōu)化后的六重PCR擴增體系和反應程序進行擴增。結果表明，應用六重PCR方法能夠從13種測試樣品中獲得1~5條特異性擴增產物片段（見圖4），且與表1所列的預期結果完全一致，未出現(xiàn)假陽性或假陰性情況，表明建立的六重PCR方法對轉基因玉米、大豆、棉花、油菜等不同類型的樣品均具有很好的特異性，具有廣泛的適用性。

圖3 多重PCR擴增體系和反應程序優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction system and program for the multiplex PCR assay

圖4 多重PCR方法的特異性測試Fig.4 Specificity of the multiplex PCR assay

2.4 六重PCR方法的靈敏度測試

用緩沖液對陽性對照樣品的DNA進行梯度稀釋，獲得每個轉化體組分的質量分數(shù)分別為5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%的6個梯度的DNA樣品，用優(yōu)化后的六重PCR擴增體系和反應程序對上述DNA測試樣品進行PCR擴增檢測。測試結果如圖5所示，應用本研究建立的六重PCR方法能夠從質量分數(shù)≥0.1%的陽性對照樣品中清晰檢測到全部6種轉基因成分，表明本方法的檢出限為0.1%，能夠滿足現(xiàn)階段轉基因成分篩選檢測的需求。

圖5 多重PCR方法的靈敏度測試Fig.5 Sensitivity of the multiplex PCR assay

3 結語

應用多重PCR技術，以目前商品化應用的轉基因作物中最具代表性的CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS終止子、bar基因、CP4-EPSPS基因和NPTII基因等6種轉基因成分為研究對象，通過特異性引物設計與篩選、反應體系和反應程序優(yōu)化等步驟，建立了能同時檢測上述6種轉基因成分的六重PCR方法。特異性和靈敏度測試結果表明，本研究建立的六重PCR方法能夠準確檢測出轉基因玉米、大豆、棉花、油菜等不同類型樣品中的預期轉基因成分，方法檢出限為0.1%，非常適用于轉基因成分檢測中對未知樣品的初步篩選。

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科技信息

A Multiplex PCR Assay for the Rapid Screening of Genetically Modified Components in Food

DONG Liming， XING Zhenjuan， LI Congcong， XIA Wei， YAN Wei， LI Feiwu*
（Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

Based on the DNA sequences of CaMV35S promoter，F(xiàn)aMV35S promoter，NOS terminator，bar gene，NPTII gene and CP4-EPSPS gene，a multiplex PCR assay for simultaneously screening the above six exogenous elements widely introduced into genetically modified organisms was established.The result showed that the highly efficient multiplex PCR system was obtained when the final primer concentrations were 0.2，0.2，0.3，0.3，0.2 and 0.2 μmol/L separately for them. The method could allow an accurate detection of six target elements from genetically modified maize，soybean，cotton and rapeseed，with the limit of detection of 0.1%.In conclusion，this multiplex PCR assay provides a highly effective approach to the screening of common transgenic components in foods and has high application value in the GMO detection.

genetically modified organisms，regulatory element，marker gene，target gene，multiplex PCR，screening

TS 207.3

A

1673—1689（2017）01—0056—06

2015-03-17

國家轉基因生物新品種培育重大專項課題（2014ZX08012-001）；吉林省農業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（2013-2016）。

董立明（1980—），男，吉林九臺人，農學碩士，助理研究員，主要從事農業(yè)轉基因生物安全研究。E-mail：dlm_510@sina.com

*通信作者：李飛武（1982—），男，湖北江陵人，農學碩士，副研究員，主要從事農業(yè)轉基因生物安全研究。E-mail：lifeiwu3394@sina.com

董立明，邢珍娟，李蔥蔥，等.應用多重PCR技術快速篩查食品中的轉基因成分[J].食品與生物技術學報，2017，36（01）：56-61.