多花黑麥草葉蛋白提取及純化工藝研究

劉俊利+許能祥+董臣飛

摘要：為探索多花黑麥草葉蛋白提取及純化工藝，采用不同的料水比、pH值和絮凝溫度進(jìn)行多花黑麥草葉蛋白的提取和選用不同純化劑進(jìn)行葉蛋白純化研究，結(jié)果表明，使用酸性熱提法提取葉蛋白效果最好。最佳提取條件為pH值為4.0，70 ℃水浴加熱10 min，葉蛋白提取率、純蛋白含量均達(dá)到最大值，分別達(dá)46.17%和53.13%。多花黑麥草葉蛋白的最佳純化試劑為醇類物質(zhì)，葉蛋白純度提高6%～7.5%，綜合考慮成本、安全等因素，推薦使用乙醇作為葉蛋白的純化劑。

關(guān)鍵詞：多花黑麥草；葉蛋白；提取；純化

中圖分類號： S816.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0343-03

隨著社會的不斷發(fā)展，人均畜產(chǎn)品需求持續(xù)增長，飼料糧的供給不足已經(jīng)成為當(dāng)前糧食安全的主要問題之一[1-2]。我國畜牧生產(chǎn)和淡水養(yǎng)殖業(yè)蛋白質(zhì)飼料缺口很大，開發(fā)并利用植物蛋白資源對緩解養(yǎng)殖業(yè)蛋白資源缺乏具有重要作用[3-6]。多花黑麥草（Lolium multiflorum）為我國長江中下游及其以南地區(qū)的重要冷季牧草，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、耐濕等優(yōu)點，是飼養(yǎng)家畜及草食性魚類的優(yōu)質(zhì)飼料，目前主要用作鮮飼和青貯，但由于多花黑麥草供草期集中，短時間內(nèi)供過于求的現(xiàn)象時有發(fā)生，而利用多花黑麥草進(jìn)行深度開發(fā)利用較少[7-10]。多花黑麥草粗蛋白含量高，利用多花黑麥草生產(chǎn)葉蛋白，對緩解我國蛋白飼料嚴(yán)重短缺有重要意義。本試驗以初穗期多花黑麥草為試驗材料，進(jìn)行葉蛋白的提取工藝優(yōu)化研究，并對葉蛋白的純化進(jìn)行了初步研究，以期為多花黑麥草葉蛋白的高效提取及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合種養(yǎng)偱環(huán)基地初穗期的多花黑麥草，多花黑麥草品種為長江2號。

1.2 多花黑麥草葉蛋白提取

1.2.1 原料前處理

稱取多花黑麥草整株100 g，清洗，剪成長1～2 cm的小段，按試驗設(shè)計的料水比加入規(guī)定量的水，打漿機(jī)打漿后，用3層紗布過濾，收集濾液，濾渣用蒸餾水洗滌2次，棄濾渣后得到的濾液即為含有多花黑麥草葉蛋白的汁液。

1.2.2 調(diào)pH值 使用HCl調(diào)節(jié)多花黑麥草汁液的pH值至設(shè)定的pH值。

1.2.3 加熱 采用恒溫水浴加熱的方法將多花黑麥草汁液加熱到設(shè)定的溫度，在水浴鍋內(nèi)恒溫一定的時間得到絮凝物。

1.2.4 冷卻離心 冷卻到室溫后裝入離心管內(nèi)，8 000 r/min離心7 min，去上清得到多花黑麥草葉蛋白濃縮物。

1.2.5 干燥 采用55 ℃恒溫干燥法對多花黑麥草葉蛋白濃縮物進(jìn)行干燥，烘干24 h至恒質(zhì)量。

1.3 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優(yōu)化

1.3.1 料水比對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草3份，按鮮葉與水的重量比例1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4（g ∶mL）分別加水，打漿、過濾，將pH值調(diào)到4，70 ℃加熱10 min，重復(fù)3次。

1.3.2 pH值對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草5份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過濾，分別將pH值調(diào)到2、4、6、8、10，70 ℃加熱10 min，重復(fù)3次。

1.3.3 絮凝溫度對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草4份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過濾，將pH值調(diào)到4，分別在40、50、60、70、80 ℃下加熱10 min，重復(fù)3次。

1.3.4 絮凝時間對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草4份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過濾，將pH值調(diào)到4，70 ℃ 分別加熱5、10、15、20 min，重復(fù)3次。

1.3.5 提取工藝的優(yōu)化 選取料水比、pH值、絮凝溫度3個因素，設(shè)計3個水平正交試驗因子的水平表（表1），按照標(biāo)準(zhǔn)正交表L9（33）進(jìn)行試驗。

1.4 葉蛋白純化

分別使用甲醇、無水乙醇、丙酮、四氯化碳、異丙醇、蒸餾水等試劑以料水比1 g ∶3 mL浸洗新鮮提取的葉蛋白粗提物，靜置12 h，3 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀烘干后測定其純化蛋白質(zhì)含量。重復(fù)3次。

1.5 計算方法

葉蛋白得率=葉蛋白干質(zhì)量多花黑麥草樣品鮮質(zhì)量×100%；

葉蛋白提取率=葉蛋白干質(zhì)量×粗蛋白含量鮮樣烘干后干基質(zhì)量×干基蛋白含量×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA程序進(jìn)行Duncans多重比較分析，不同指標(biāo)的平均值通過SAS 9.2 軟件采用Fishers LSD法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的研究

2.1.1 料水比對葉蛋白提取的影響 不同料水比提取葉蛋白的試驗結(jié)果（表2）表明，隨著料水比的提高，提取物中蛋白質(zhì)的含量也逐漸增高，當(dāng)料水比為1 g ∶3 mL時，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，之后呈降低趨勢；而葉蛋白提取率和蛋白質(zhì)的含量呈相關(guān)關(guān)系，在料水比為1 g ∶3 mL時，葉蛋白的提取率最高，為45.39%，顯著高于料水比為1 g ∶4 mL的提取率（41.77%），但料水比為1 g ∶2 mL和1 g ∶3 mL的葉蛋白提取率差異不顯著。

2.1.2 pH值對葉蛋白提取的影響

不同的pH值條件下，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率差異均達(dá)到顯著和極顯著水平。當(dāng)pH值從2增加到4時，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率均達(dá)到最高，分別為52.08%和45.95%，顯著高于pH值為2時的46.82%和39.92%；當(dāng)pH值逐漸增大，溶液由酸性變?yōu)橹行灾翂A性時，蛋白沉淀量與提取率迅速下降，堿性越大，蛋白含量與提取率越低（表3）。

2.1.3 絮凝溫度對葉蛋白提取的影響

絮凝溫度升到 50 ℃，多花黑麥草中葉蛋白開始絮凝沉淀，蛋白沉淀量隨著溫度的升高而逐漸增加，并最終趨于平穩(wěn)（表4）。由表4可見，當(dāng)溫度由60 ℃升到70 ℃時，多花黑麥草蛋白質(zhì)含量逐漸增大，從70 ℃升到80 ℃時，蛋白質(zhì)含量下降，可見由60 ℃到80 ℃，蛋白質(zhì)含量先增大后降低，70 ℃時的蛋白質(zhì)含量（52.39%）顯著高于其他溫度；而從葉蛋白提取率來看，隨著溫度的逐漸升高，提取率一直呈增加狀態(tài)，但增加速度逐漸趨于平緩。綜上可知，70 ℃是提取葉蛋白的最佳絮凝溫度。

2.1.4 絮凝時間對葉蛋白提取的影響

在料水比 1 g ∶3 mL，pH值為4，70 ℃的絮凝溫度下，將多花黑麥草汁液分別加熱不等的時間。由表5可以看出，絮凝時間對多花黑麥草葉蛋白提取的影響較小。加熱5 min與加熱10 min蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率都較高，相比之下加熱10 min效果更好，提取率（45.97%）最高。

2.1.5 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優(yōu)化

正交試驗結(jié)果（表6）顯示，各因素對蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率都有顯著影響。按照極差R的大小，影響多花黑麥草中蛋白質(zhì)含量因素的大小順序為C>B>A，即絮凝溫度>pH值>料水比；影響多花黑麥草中葉蛋白提取率因素的大小順序為B>A>C，即pH值>料水比>絮凝溫度。表中計算分析后的最佳組合條件為A2B2C3，在料水比為1 g ∶3 mL、pH值為4、絮凝溫度 70 ℃ 的條件下，蛋白質(zhì)含量53.13%，葉蛋白提取率 46.17%，2項指標(biāo)均為最高值。

2.2 多花黑麥草葉蛋白的純化

分別用甲醇、無水乙醇、丙酮、四氯化碳、異丙醇、蒸餾水等試劑對新鮮提取的多花黑麥草葉蛋白粗提物進(jìn)行萃取純化。試驗結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)未使用純化劑時，對照組中多花黑麥草葉蛋白的蛋白純度在56%左右；使用純化劑后，在各種純化劑作用下葉蛋白的蛋白純度均有所上升，影響大小依次為丙酮>乙醇 >甲醇>異丙醇>四氯化碳>水。其中丙酮的純化效果最好，蛋白質(zhì)純度達(dá)到67%；乙醇次之，為64%；水的效果最差，僅為57%，而甲醇、異丙酮及四氯化碳之間差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 多花黑麥草葉蛋白提取工藝

試驗中，當(dāng)料水比達(dá)到1 g ∶3 mL、pH值為4、絮凝溫度為 70 ℃、絮凝時間為10 min時，提取物中蛋白質(zhì)含量最高為 53.13%，且葉蛋白提取率也最高，為46.17%。從料水比來看，打漿過程中，加水量太少，使得多花黑麥草鮮樣浸泡不充分，打漿不徹底，葉蛋白不能充分提取；隨著加水量增多，雖然樣品中葉蛋白得到充分浸泡與提取，但是同樣會溶解較多的細(xì)小纖維與色素，加熱過程中蛋白不能完全絮凝沉淀，仍溶解在濾液中，造成提取率下降。

蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境pH值發(fā)生改變時，其表面的電荷量會隨著溶液pH值的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化。在多花黑麥草葉蛋白提取過程中，提取液pH值為4時蛋白絮凝沉淀量最大且葉蛋白提取率最高，表明多花黑麥草葉蛋白呈酸性。

溫度是影響蛋白質(zhì)含量的重要因素。絮凝溫度在50～80 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，多花黑麥草葉蛋白的提取率也隨之增加，并逐漸緩和，因為葉蛋白不但受加熱變性的影響，同時還要受等電點沉淀因素的作用，蛋白凝聚機(jī)會和敏感性得以增加，從而使葉蛋白凝聚速度加快，絮凝出的物質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密且易分離，保證了葉蛋白的高提取率。隨著絮凝時間的延長，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率變化相差不大，并不隨時間的延長而增加，這說明絮凝時間并不是影響多花黑麥草葉蛋白提取的主要因素。

從選取影響葉蛋白提取的衡量指標(biāo)來看，大部分類似的試驗主要考慮葉蛋白得率，但是由于葉蛋白中粗蛋白含量會隨著試驗參數(shù)的改變而發(fā)生較大的變化，所以蛋白質(zhì)含量這一指標(biāo)不能準(zhǔn)確且全面地反映從多花黑麥草中提取的蛋白質(zhì)情況，同理，葉蛋白得率也是如此，為彌補(bǔ)此項不足，通過增加葉蛋白提取率來補(bǔ)充反映蛋白質(zhì)的提取情況。本試驗在多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優(yōu)化中，綜合考慮蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率2項指標(biāo)的結(jié)果，同時兼顧生產(chǎn)成本及絮凝時間，選擇料水比1 g ∶3 mL、pH值4、絮凝溫度70 ℃、絮凝時間 10 min 為最佳試驗條件，在該條件下，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率均可達(dá)到最高值，該結(jié)果與楊朝英等報道的試驗結(jié)果[11]相一致。

3.2 多花黑麥草葉蛋白的純化

鮮樣中提取的多花黑麥草葉蛋白，由于其中含有多種植物色素如葉綠素、類胡蘿卜素，類脂化合物以及能夠?qū)е虏涣細(xì)馕都邦伾亩喾宇愇镔|(zhì)，對其利用有不利影響，而通過使用有機(jī)溶劑進(jìn)行純化，不但除去了這些不良物質(zhì)，還提高了葉蛋白的純度[12-13]。本試驗通過使用各種有機(jī)溶劑，提高葉蛋白純度百分點左右，純化后的多花黑麥草葉蛋白顏色變淺，無異味，蛋白質(zhì)含量明顯升高。而采用水進(jìn)行純化效果最差，因為葉綠素類物質(zhì)不溶于水中；采用丙酮的純化效果最好，但是丙酮具有強(qiáng)的刺激性，且易燃易爆，因此，不推薦丙酮作為純化劑大量使用；醇類效果也較好，其中乙醇作為純化劑，不但可除去植物色素、類脂化合物及多酚類化合物，而且其成本較低、對人體無毒、易于回收，因此，推薦使用乙醇作為葉蛋白的純化劑。

參考文獻(xiàn)：

[1]張炳武，張新躍. 我國南方高效牧草種植系統(tǒng)[J]. 草業(yè)科學(xué)，2013，30（2）：259-265.

[2]王宇濤，辛國榮，陳三有，等. 意大利黑麥草飼喂奶牛效果[J]. 草業(yè)科學(xué)，2008，25（10）：118-123.

[3]王向峰，林潔榮. 葉蛋白飼料的研究進(jìn)展[J]. 福建畜牧獸醫(yī)，2007，29（3）：46-48.

[4]李立人. 國際葉蛋白的研究及開發(fā)[J]. 中國飼料，1995（14）：10-12.

[5]楊文華，林曉春，叢德馨. 植物葉蛋白的生產(chǎn)與利用研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報，1998（3）：76-80.

[6]陳文榮，邱業(yè)先. 葉蛋白資源的利用現(xiàn)狀及展望[J]. 食品科學(xué)，2003，24（2）：158-161.

[7]姜 華，畢玉芬，何承剛. 不同時期刈割對黑麥草生產(chǎn)性能、蛋白質(zhì)含量及光合效率的影響[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，18（2）：149-152.

[8]丁成龍，顧洪如，許能祥，等. 不同刈割期對多花黑麥草飼草產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報，2011，20（6）：186-194.

[9]劉曉穎. 黑麥草葉蛋白等營養(yǎng)成分的提取及性質(zhì)分析[J]. 安徽大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，31（4）：81-84.

[10]楊秀梅，張偉欣，高亮之，等. 牧草生產(chǎn)潛力模擬模型及其應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（2）：322-327.

[11]楊超英，劉 艷，薛正蓮，等. 黑麥草葉蛋白提取工藝研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（5）：14-17.

[12]楊春波. 苜蓿葉蛋白的提取與應(yīng)用研究[D]. 無錫：江南大學(xué)，2007.

[13]李憲剛，張 靜，李予霞，等. 乙醇純化苜蓿葉蛋白效果初探[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2007，13（5）：38-39.