哇巴因調控Akt/mTOR信號通路誘導U87—MG細胞死亡的機制研究

楊小颯　李培炎　李杰

[摘要] 目的 探討哇巴因（ouabain）對人膠質瘤U87-MG細胞死亡的影響及具體機制。 方法 將培養的U87-MG細胞隨機分為正常對照（Control）組和ouabain組，分別加入常規培養基和不同濃度ouabain（0.05、0.5、2.5、25 μmol/L）干預24 h，光學顯微鏡觀察ouabain干預后24 h細胞的形態改變，MTT實驗檢測細胞活力，免疫印跡法（Western blot）檢測Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達變化。 結果 與Control組比較，ouabain顯著降低U87-MG細胞活力（均P < 0.01），且呈現濃度依賴性；高濃度ouabain（2.5、25 μmol/L）與Control組相比能夠降低U87-MG細胞中p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達（均P < 0.01）。 結論 高濃度ouabain可能通過抑制胞內Akt/mTOR信號通路，降低腫瘤細胞活力并最終引起細胞死亡。

[關鍵詞] 哇巴因；膠質瘤；人膠質瘤U87-MG細胞；Akt/mTOR信號通路

[中圖分類號] R730.264 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the effect of ouabain on the human glioma U87-MG cells death and the underlying mechanism. Methods U87-MG cells were randomly divided into control group and ouabain group， which were treated with conventional medium and different concentrations of ouabain （0.05， 0.5， 2.5 and 25 μmol/L） for 24 h， respectively. The morphologic changes induced by ouabain treatment were observed with the light microscope. Cell viability was assessed with MTT assay and Western blot was used to detect the protein expression of Akt， p-Akt， mTOR and p-mTOR. Results Compared to control group， the viability of U87-MG cells treated with ouabain was significantly reduced （all P < 0.01） in a dose-dependent manner. Besides， Western blot indicated that higher concentrations of ouabain （2.5 and 25 μmol/L） downregulated the expression of p-Akt， mTOR and p-mTOR when compared to control group （all P < 0.01）. Conclusion Higher concentrations of ouabain depressed U87-MG cells viability and ultimately induced cell death via suppression of Akt/mTOR signaling pathway.

[Key words] Ouabain； Glioma； Human glioma U87-MG cells； Akt/mTOR signaling pathway

膠質瘤（glioma）是惡性程度最高的常見原發性腦腫瘤之一，約占中樞神經系統惡性腫瘤的80%[1]，盡管目前已有多種治療方案，但膠質瘤患者的中位生存期僅為14個月，治療失敗的主要原因是逐漸增強的化、放療抵抗[2]，因此亟待發現新的治療策略以提高膠質瘤患者的治療效果。

哇巴因（ouabain）等強心苷類藥物對心肌收縮力的積極作用源于其對Na+/K+-ATP酶的高度特異性抑制，在臨床上被用于治療心力衰竭和其他心臟疾病[3]。最新研究表明，ouabain等強心苷類藥物能夠通過調節胞內多種信號通路抑制腫瘤細胞的增殖，阻斷腫瘤的生長[4]。盡管已有較多的數據證明ouabain具有抗癌作用，但具體機制尚不明確。

Akt/mTOR信號通路是參與調節細胞生長、凋亡和細胞骨架重排的重要胞內信號轉導通路，在腫瘤形成和和病理進展過程中發揮重要作用[5]。作為癌癥中最常見的異常調節激酶通路，Akt/mTOR信號通路被證實是多種癌癥的治療靶點[6]。因此，本文以人膠質母細胞瘤U87-MG細胞為研究對象，觀察特異性Na+/K+-ATP酶抑制劑ouabain對其凋亡的影響，初步探討Akt/mTOR信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人膠質瘤U87-MG細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），ouabain（美國Sigma公司），DMEM高糖培養基、胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gibco公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Promega公司），兔抗人一抗Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin（美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（美國KPL公司），Amersham Imager 600化學發光成像系統（美國GE公司）。

1.2 細胞培養

U87-MG細胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，置于37℃培養箱（5% CO2）常規培養，細胞匯合度達90%后消化傳代，常規培養7 d后進行后續實驗。將U87-MG細胞分為正常對照（Control）組和ouabain（0.05、0.5、2.5、25 μmol/L）組。Control組不進行ouabain干預。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

U87-MG細胞以5×104個/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL。常規培養24 h后，ouabain組細胞加入含不同濃度ouabain的培養基，Control組加入等體積的常規培養基，空白孔單加培養基，每組設5個復孔，繼續培養24 h。之后每孔加入20% MTT，置于37℃培養箱孵育2 h，酶標儀測定490 nm處的OD值，計算細胞活力。細胞活力=（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）×100%，使用GraphPad Prism 6.0軟件制作統計圖。

1.4 Western blot檢測蛋白表達量

U87-MG細胞經不同濃度ouabain干預24 h后，PBS漂洗3次，加入RIPA蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，將細胞收集至1.5 mL離心管，使用組織破碎儀3000次/min破碎3 min，12000 r/min離心取上清，-80℃保存待用。將各組的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后使用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR，1∶1000稀釋）4℃孵育過夜，相應二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h，TBST充分洗膜。滴加ECL顯影液，放入Amersham Imager 600中進行顯影。采用Image J灰度分析軟件測定蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對表達量以目的蛋白與β-actin的蛋白條帶灰度值之比表示。

1.5 統計學方法

使用SPSS 15.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ouabain對U87-MG細胞活力的影響

ouabain干預24 h后，U87-MG細胞出現形態不規則、折光度變差、皺縮甚至漂浮，隨著ouabain濃度的增加，死細胞數量逐漸增多（圖1）。MTT結果顯示，ouabain處理24 h后U87-MG細胞活力與Control組比較均顯著降低（均P < 0.01），且呈現濃度依賴性（圖2）。

2.2 ouabain對U87-MG細胞Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

與Control組比較，0.05 μmol/L ouabain組p-Akt蛋白表達量上升（P < 0.01），而mTOR和p-mTOR下降（P < 0.05或P < 0.01）。與Control組相比，0.5 μmol/L ouabain僅降低p-Akt表達（P < 0.01）。另外，較高濃度ouabain（2.5、25 μmol/L）與Control組相比均能降低p-Akt、mTOR和p-mTOR表達（P < 0.05或P < 0.01）。然而，不同濃度ouabain對Akt表達無顯著影響（P > 0.05）（圖3）。

3 討論

膠質瘤是神經系統最常見的惡性腫瘤之一，臨床預后較差，因而關于其治療策略的研究成為近年來的焦點[7]。由于人膠質瘤U87-MG細胞對強心苷類藥物較為敏感，而且ouabain作為一種液態、可溶的強心苷類藥物可通過血腦屏障[8]，因此本文采用ouabain干預U87-MG細胞，開展膠質瘤治療的實驗研究。

在膠質瘤發生過程中，Na+/K+-ATP酶不僅能夠穩定離子平衡，更在腫瘤進展中發揮重要作用[9]。Ahmed等[10]研究表明，抑制Na+/K+-ATP酶活性可影響細胞黏附和遷移功能，并阻斷胞內PKC、NF-κB等信號通路，從而引起腫瘤細胞凋亡。ouabain等強心苷類藥物是Na+/K+-ATP酶的天然抑制劑，在其α亞基上有多個強心苷類藥物的結合位點[11]。Lin等[12]研究發現，ouabain能降低Na+/K+-ATP酶α亞基的含量，抑制其活性，減弱腫瘤細胞生長能力，從而引起腫瘤細胞死亡。Trenti等[13]研究表明，ouabain通過調控Na+/K+-ATP酶的反向轉運功能以及下調抗凋亡蛋白Bcl-2，從而抑制腫瘤細胞的增殖。本實驗通過不同濃度ouabain干預后發現，U87-MG細胞活力較Control組明顯降低，并呈濃度依賴性，這提示ouabain能促進膠質瘤U87-MG細胞凋亡，可能與改變胞內某些信號通路有關。

研究表明，Na+/K+-ATP酶可在Akt/mTOR、Ras和PKC等多種信號通路中發揮作用[14]，促進腫瘤的侵襲和轉移，其中Akt/mTOR通路對于膠質瘤等多種腫瘤的病理進展至關重要[15]。Akt、mTOR以及磷酸化蛋白的上調表達，可直接或間接抑制Bax、caspase-9等凋亡相關蛋白的磷酸化，降低細胞凋亡，從而引起正常生理功能的惡化[16]。另外，mTOR被證實其磷酸化激活受到AMPK等其他通路的抑制，而AMPK/mTOR通路參與細胞自噬的負性調節，由于細胞自噬能夠促進藥物對腫瘤的抑制，因此該通路可促進腫瘤的生長[17]。Liu等[18]研究發現，Akt/mTOR通路抑制膠質瘤中的細胞凋亡，藥物抑制Akt/mTOR通路以及Akt、mTOR的磷酸化可上調下游凋亡相關蛋白，從而導致腫瘤細胞的大量凋亡。研究表明，ouabain能夠通過調節PI3K、Ras和PKC等信號通路，降低Akt、mTOR的磷酸化，減弱細胞生長能力，從而引起腫瘤細胞凋亡[19]。Wang等[20]研究表明，ouabain和地高辛等強心苷類藥物能夠增強AMPK的磷酸化激活從而降低mTOR磷酸化水平，并通過調節ERK1/2和AMPK/mTOR等胞內信號通路引起細胞自噬，從而發揮抗腫瘤作用。本實驗中，Western blot結果顯示，0.05 μmol/L ouabain導致p-Akt表達升高而mTOR和p-mTOR表達下降，可能是由于低濃度ouabain對Na+/K+-ATP酶的輕度抑制，刺激了細胞內Akt等信號通路的活化，從而導致Akt的磷酸化活性形式p-Akt有所增加，而mTOR可能受到AMPK信號通路的調控導致其自身以及磷酸化活性形式p-mTOR都有所下降；當ouabain濃度增加至0.5 μmol/L時，Akt的磷酸化激活由于ouabain的濃度增加而有所降低，但mTOR可能受到Akt通路的磷酸化激活同時又被AMPK通路所抑制，因而其磷酸化水平未發生變化；高濃度ouabain（2.5、25 μmol/L）能夠降低Akt和mTOR的磷酸化水平，同時U87-MG細胞活力受到抑制，且形態學也顯示了嚴重的細胞死亡。上述結果表明，高濃度的ouabain可能通過抑制胞內Akt/mTOR通路，抑制U87-MG細胞生長進而引起細胞死亡，發揮抗膠質瘤作用。

綜上所述，本文采用不同濃度ouabain干預人膠質瘤U87-MG細胞后發現，高濃度ouabain通過下調Akt/mTOR信號通路相關蛋白，抑制U87-MG細胞活力，從而導致細胞死亡，這為ouabain抗腫瘤特性的機制研究提供了更多的數據支撐，更提示ouabain可作為膠質瘤治療的潛在用藥。

[參考文獻]

[1] Lee JW，Lim DH，Sung KW，et al. Tandem High-Dose Chemotherapy and Autologous Stem Cell Transplantation for High-Grade Gliomas in Children and Adolescents [J]. J Korean Med Sci，2017，32（2）：195-203.

[2] Jain A，Lai JC，Bhushan A. Biochanin A inhibits endothelial cell functions and proangiogenic pathways：implications in glioma therapy [J]. Anticancer Drugs，2015，26（3）：323-330.

[3] Kulikov A，Eva A，Kirch U，et al. Ouabain activates signaling pathways associated with cell death in human neuroblastoma [J]. Biochim Biophys Acta，2007，1768（7）：1691-1702.

[4] Kepp O，Menger L，Vacchelli E，et al. Anticancer activity of cardiac glycosides：At the frontier between cell-autonomous and immunological effects [J]. Oncoimmunology，2012，1（9）：1640-1642.

[5] Chakravarti A，Zhai G，Suzuki Y，et al. The prognostic significance of phosphatidylinositol 3-kinase pathway activation in human gliomas [J]. J Clin Oncol，2004，22（10）：1926-1933.

[6] Santarpia L，Lippman SM，El-Naggar AK. Targeting the MAPK-RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy [J]. Expert Opin Ther Targets，2012，16（1）：103-119.

[7] Zhu D，Tu M，Zeng B，et al. Up-regulation of miR-497 confers resistance to temozolomide in human glioma cells by targeting mTOR/Bcl-2 [J]. Cancer Med，2017. [Epub ahead of print]

[8] Hertz L，Peng L，Song D. Ammonia，like K（+），stimulates the Na（+），K（+），2Cl（-）cotransporter NKCC1 and the Na（+），K（+）-ATPase and interacts with endogenous ouabain in astrocytes [J]. Neurochem Res，2015，40（2）：241-257.

[9] Ono Y，Chiba S，Yano H，et al. Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B（GPNMB）promotes the progression of brain glioblastoma via Na（+）/K（+）-ATPase [J]. Biochem Biophys Res Commun，2016，481（1-2）：7-12.

[10] Ahmed Z，Deyama Y，Yoshimura Y，et al. Cisplatin sensitivity of oral squamous carcinoma cells is regulated by Na+，K+-ATPase activity rather than copper-transporting P-type ATPases，ATP7A and ATP7B [J]. Cancer Chemother Pharmacol，2009，63（4）：643-650.

[11] Xie Z. Molecular mechanisms of Na/K-ATPase-mediated signal transduction [J]. Ann N Y Acad Sci，2003，986：497-503.

[12] Lin Y，Ho DH，Newman RA. Human tumor cell sensitivity to oleandrin is dependent on relative expression of Na+，K+-ATPase subunitst [J]. J Exp Ther Oncol，2010，8（4）：271-286.

[13] Trenti A，Grumati P，Cusinato F，et al. Cardiac glycoside ouabain induces autophagic cell death in non-small cell lung cancer cells via a JNK-dependent decrease of Bcl-2 [J]. Biochem Pharmacol，2014，89（2）：197-209.

[14] Liu M，Feng LX，Sun P，et al. Knockdown of Apolipoprotein E Enhanced Sensitivity of Hep3B Cells to Cardiac Steroids via Regulating Na+/K+-ATPase Signalosome [J]. Mol Cancer Ther，2016，15（12）：2955-2965.

[15] Wu J，Akkuratov EE，Bai Y，et al. Cell signaling associated with Na+/K+-ATPase： activation of phosphatidylinositide 3-kinase IA/Akt by ouabain is independent of Src [J]. Biochemistry，2013，52（50）：9059-9067.

[16] Song G，Ouyang G，Bao S. The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival [J]. J Cell Mol Med，2005，9（1）：59-71.

[17] Wang SY，Yu QJ，Zhang RD，et al. Core signaling pathways of survival/death in autophagy-related cancer networks [J]. Int J Biochem Cell Biol，2011，43（9）：1263-1266.

[18] Liu Y，Zheng J，Zhang Y，et al. Fucoxanthin activates apoptosis via inhibition of PI3K/Akt/mTOR pathway and suppresses invasion and migration by restriction of p38-MMP-2/9 pathway in human glioblastoma cells [J]. Neurochem Res，2016. [Epub ahead of print]

[19] Wolle D，Lee SJ，Li Z，et al. Inhibition of epidermal growth factor signaling by the cardiac glycoside ouabain in medulloblastoma [J]. Cancer Med，2014，3（5）：1146-1158.

[20] Wang Y，Qiu Q，Shen JJ，et al. Cardiac glycosides induce autophagy in human non-small cell lung cancer cells through regulation of dual signaling pathways [J]. Int J Biochem Cell Biol，2012，44（11）：1813-1824.

（收稿日期：2016-10-12 本文編輯：程 銘）