新生兒先天性巨結(jié)腸活檢標(biāo)本中Calretinin的診斷作用

趙 麗，趙林勝，趙緒穩(wěn)，張愛華，胡曉麗

新生兒先天性巨結(jié)腸活檢標(biāo)本中Calretinin的診斷作用

趙 麗1，趙林勝1，趙緒穩(wěn)2，張愛華1，胡曉麗1

目的探討 Calretinin在新生兒先天性巨結(jié)腸（hirschsprung disease，HD）活檢標(biāo)本中診斷的作用，為 HD的早期準(zhǔn)確診斷提供有益的幫助。方法收集疑似 HD患兒首次行腸黏膜活檢標(biāo)本51例，分別行常規(guī) HE及免疫組化 EnVision法染色，判讀黏膜下層有無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并對(duì) Calretinin的染色特點(diǎn)、分布情況進(jìn)行觀察。結(jié)果51例活檢標(biāo)本中，鏡下見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，同時(shí) Calretinin染色陽性者 8例，排除HD診斷。HE染色未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，同時(shí)Calretinin染色陰性者39例，后經(jīng)手術(shù)證實(shí)均為HD。剩余4例，其中2例 HE染色未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但 Calretinin染色陽性，亦排除 HD的診斷；另2例因黏膜下層組織稀少，未見Calretinin染色陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但黏膜固有層內(nèi)可見 Calretinin染色陽性的神經(jīng)纖維，再次活檢證實(shí)有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。結(jié)論新生兒及小嬰兒由于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育不成熟，HE染色不易觀察。因此，免疫組化標(biāo)記 Calretinin的表達(dá)對(duì)新生兒HD診斷具有重要的輔助作用。

先天性巨結(jié)腸；Calretinin；免疫組織化學(xué)

先天性巨結(jié)腸（hirschsprung disease，HD）是胚胎時(shí)期神經(jīng)脊的神經(jīng)母細(xì)胞遷移障礙導(dǎo)致的先天性消化道畸形，其病理特點(diǎn)是病變腸管的黏膜下及肌間神經(jīng)叢中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，常伴異常增生的膽堿能神經(jīng)纖維，最常累及直腸、乙狀結(jié)腸，也可累及全結(jié)腸，偶可累及小腸［1］。直腸黏膜活檢是診斷 HD的金標(biāo)準(zhǔn)，然而實(shí)際工作中，病理醫(yī)師在小的活檢標(biāo)本中判斷是否存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是非常困難的［2］。因此尋找更為特異、靈敏的抗體來辨別神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Calretinin屬于重要的鈣結(jié)合蛋白，在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。文獻(xiàn)報(bào)道［3－5］，免疫組化標(biāo)記Calretinin染色結(jié)果讀取直觀，對(duì)病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)度依賴不高：即在腸壁黏膜固有層、黏膜下層或肌間有 Calretinin染色陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或神經(jīng)纖維即可排除HD的診斷，反之 Calretinin表達(dá)缺失則支持HD診斷。本文著重探討免疫組化標(biāo)記Calretinin染色在新生兒及小嬰兒腸活檢標(biāo)本中的診斷作用，旨在為 HD的早期診斷提供有益的幫助。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年1月 ～2015年12月天津市兒童醫(yī)院疑似 HD患兒首次行腸黏膜活檢的標(biāo)本 51例，其中男嬰36例，女嬰15例；患兒年齡均≤3個(gè)月，其中年齡最小者1天，最大者3個(gè)月，平均 43天。患兒臨床癥狀：24 h內(nèi)無胎便排出、胎便排出延遲、腹脹、嘔吐、便秘、腸穿孔、小腸結(jié)腸炎等。

1.2 方法所有組織均為直腸黏膜活檢標(biāo)本，取材部位在齒狀線上3 cm。標(biāo)本均經(jīng) 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片約 50張，常規(guī)HE染色及免疫組化 EnVision法染色，一抗購自上海長(zhǎng)島公司，二抗及 Ventana全自動(dòng)免疫組化儀購自羅氏公司，用 PBS代替一抗作陰性對(duì)照，闌尾組織作陽性對(duì)照。由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法對(duì)51例活檢標(biāo)本的HE切片進(jìn)行閱片，顯微鏡下尋找神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；并對(duì)免疫組化標(biāo)記Calretinin的表達(dá)進(jìn)行判斷。

1.3 結(jié)果判斷常規(guī) HE染色在黏膜下層查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞即排除 HD診斷；在黏膜固有層或黏膜下層查見 Calretinin染色陽性的神經(jīng)纖維或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亦排除 HD診斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間率的比較采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HE染色51例活檢標(biāo)本中，HE染色查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞8例（圖1），39例未查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；2例黏膜下層組織稀少未查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，建議再次行活檢；2例黏膜下層內(nèi)未見典型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（圖2），建議再次活檢或免疫組化染色證實(shí)。

2.2 免疫組化染色Calretinin表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（包括不成熟神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）的胞質(zhì)及胞核（圖 3、4），黏膜固有層及黏膜下層神經(jīng)纖維亦呈陽性。51例活檢標(biāo)本中 Calretinin染色陽性者10例，Calretinin染色陰性者39例（圖5）；其中39例Calretinin陰性者后經(jīng)手術(shù)證實(shí)均為 HD。2例直腸活檢標(biāo)本由于黏膜下層組織少，未查見 Calretinin染色陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但黏膜固有層內(nèi)見染色陽性的神經(jīng)纖維（圖6），遂再次活檢在黏膜下層內(nèi)查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，排除 HD。

圖1 HE染色可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 圖2 HE染色未見神經(jīng)叢及典型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 圖3 Calretinin在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維中呈陽性，EnVision法 圖4 Calretinin在不典型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中呈陽性（與圖2為同一張切片的同一部位），EnVision法 圖5 HD中未見Calretinin陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維，EnVision法 圖6 非 HD中黏膜固有層可見Calretinin陽性的神經(jīng)纖維，EnVision法

2.3 兩種染色的相關(guān)性分析HE染色查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排除 HD診斷合計(jì)8例（8／51）；Calretinin染色查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或神經(jīng)纖維排除 HD診斷合計(jì) 12例（12／51）。校正后 χ2值為26.00，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示免疫組化標(biāo)記 Calretinin更有助于 HD診斷。

3 討論

HD是兒科常見的疾病，活產(chǎn)兒發(fā)生率為 1／5 000，遺傳特性復(fù)雜［6］，男女比為 4∶1。理論上 HE染色未查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞同時(shí)伴異常增生的粗大神經(jīng)叢即可診斷 HD。對(duì)于手術(shù)根治的腸管標(biāo)本診斷較易，但對(duì)于術(shù)前腸黏膜活檢標(biāo)本［7］，特別是月齡小于 3個(gè)月的新生兒及小嬰兒診斷較為困難。原因如下：（1）新生兒及小嬰兒腸壁薄弱，為防止腸穿孔的發(fā)生，臨床醫(yī)師取活檢時(shí)會(huì)十分小心，標(biāo)本往往小而且薄，黏膜下層標(biāo)本取材不足（未達(dá)黏膜下Meissner神經(jīng)叢）［8］；（2）新生兒及小嬰兒腸壁內(nèi)常見發(fā)育不成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，如果病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)不足，可能會(huì)遺漏；（3）與年齡較大的嬰兒相比，新生兒及小嬰兒黏膜下層的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較為稀疏，所以不易觀察［9］。雖然 HE染色仍是診斷HD的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是對(duì)于上述這些問題，僅僅依靠 HE染色診斷 HD可能會(huì)導(dǎo)致誤、漏診。

乙酰膽堿酯酶（AchE）染色和免疫組化染色常被用于HD的輔助診斷，但均有一定的局限性。如AchE染色需要冷凍切片，結(jié)果的判定具有很強(qiáng)的主觀性，且靈敏度不高，特別是在新生兒及嬰兒中，其敏感性分別為 40.0%和 88.8%［10］。Calretrinin是一種 Vitamin D依賴的鈣結(jié)合蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為 2.9×104，主要表達(dá)在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)重要的活性物質(zhì)，可緩沖胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的濃度，具有神經(jīng)保護(hù)作用。2004年Barshack等首次提出 Calretinin僅在HD腸切除標(biāo)本的有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段表達(dá)，而在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段表達(dá)缺失。2011年 Hiradfar等對(duì)腸壁全層的Calretinin染色結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各種類型 HD痙攣段固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層 Calretinin染色均陰性，而有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段及非 HD患兒腸壁各層 Calretinin染色均陽性，該研究證實(shí)Calretinin對(duì)診斷 HD具有很高的靈敏度及特異性［11］。此外Kapur等［9］證實(shí)在腸活檢標(biāo)本中通過免疫組化標(biāo)記 Calretinin診斷 HD要優(yōu)于 AchE染色，且操作簡(jiǎn)便結(jié)果直觀易于讀取。因此，Calretinin在診斷或排除 HD診斷時(shí)具有其他抗體不能比擬的優(yōu)勢(shì)，特別是對(duì)于腸黏膜活檢標(biāo)本。

有學(xué)者認(rèn)為，如果想要得到確切的診斷結(jié)果，活檢標(biāo)本一般至少需要 2塊，每一塊的直徑≥3 mm，且要有足夠的黏膜下層。一些研究指出，9%～17%的活檢標(biāo)本黏膜下層不足。本組中，51例活檢標(biāo)本中僅有2例黏膜下層標(biāo)本取材不足（2／51），發(fā)病率低于文獻(xiàn)報(bào)道，可能與我們經(jīng)常和臨床醫(yī)師溝通，強(qiáng)調(diào)活檢標(biāo)本大小及深度有關(guān)。對(duì)于這2例取材不足的標(biāo)本，HE染色及免疫組化標(biāo)記 Calretinin染色均未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，而固有層內(nèi)可見 Calretinin染色陽性的神經(jīng)纖維，經(jīng)再次活檢查見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。作者認(rèn)為如果黏膜下層內(nèi)存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，則神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)出的突觸可延伸至固有層內(nèi)，因此對(duì)取材不足的標(biāo)本，固有層內(nèi)出現(xiàn) Calretinin染色陽性的神經(jīng)纖維，對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存在有提示作用。國(guó)內(nèi)張文等發(fā)現(xiàn)非 HD腸黏膜活檢標(biāo)本中固有層內(nèi)可見多少不等的Calretinin染色陽性纖維絲結(jié)構(gòu)，密集區(qū)域染色陽性的纖維絲可形成網(wǎng)狀模式，而 HD患者整個(gè)黏膜層 Calretinin染色陰性或僅見1～2根 Calretinin染色陽性的神經(jīng)纖維，兩者之間差異非常突出，接近 10倍［7］。本組中 10例有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的活檢標(biāo)本中，黏膜固有層內(nèi)均可見 Calretinin陽性的神經(jīng)纖維，而39例無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病例中，固有層內(nèi)除肥大細(xì)胞染色陽性且呈點(diǎn)狀分布外，均未見 Calretinin染色陽性的神經(jīng)纖維。提示在 HD的診斷中，即使取材表淺，但根據(jù)固有層內(nèi)Calretinin染色陽性神經(jīng)纖維的有無及數(shù)量，可以對(duì)是否存在HD做出診斷，這就對(duì)取材的要求大大降低，從而減少重復(fù)活檢或進(jìn)行結(jié)腸全層活檢的比例，但如何進(jìn)行量化判斷，作者認(rèn)為需要大樣本的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

對(duì)于新生兒及小嬰兒，腸壁內(nèi)常見發(fā)育不成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，這些未成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體小，核小，未見核仁，幾乎未見胞質(zhì)，最小的僅略大于紅細(xì)胞，因此 HE染色時(shí)不宜觀察，特別是在活檢標(biāo)本中，由于組織較小黏膜下層神經(jīng)節(jié)細(xì)胞稀疏，因此更容易遺漏，從而誤診為 HD。本組以≤3個(gè)月的新生兒及嬰兒為分析對(duì)象，其中 2例活檢標(biāo)本，即便是兩位高年資的兒科病理醫(yī)師僅憑 HE染色也不能明確有無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；而通過免疫組化標(biāo)記Calretinin染色，在黏膜下層內(nèi)可見染色陽性、未成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，避免了再次活檢，給患兒減輕痛苦。國(guó)外 Melanie等［12］報(bào)道，Calretinin免疫反應(yīng)最早可出現(xiàn)在妊娠22周的胎兒內(nèi)，因此 Calretinin可用于嬰兒甚至是早產(chǎn)兒 HD的診斷。由此可見，Calretinin在發(fā)育不成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中亦可表達(dá)，其在診斷 HD時(shí)不受患兒年齡的限制，有利于早期診斷及治療。

此外，本組39例 HE染色陰性的病例，Calretinin染色亦陰性，但是常規(guī) HE染色診斷 HD需要連續(xù)切片 50～75張，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且診斷醫(yī)師需要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，如診斷者經(jīng)驗(yàn)不足，很容易將內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞混淆。免疫組化標(biāo)記 Calretinin結(jié)果易于讀取和判斷，對(duì)診斷者經(jīng)驗(yàn)度依賴不高。Guinard等［13］報(bào)道12例 HD的病例，通過 HE 及 AchE染色均不能診斷需再次進(jìn)行活檢，Calretinin則均診斷正確。

越來越多的報(bào)道證實(shí)免疫組化標(biāo)記 Calretinin染色在診斷 HD時(shí)優(yōu)勢(shì)明顯，其對(duì)活檢標(biāo)本的要求較低，在未成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中亦呈陽性，且顯色清晰，易于判讀。因此，我們認(rèn)為腸黏膜活檢常規(guī)HE染色 ＋免疫組化標(biāo)記 Calretinin染色可以作為診斷 HD的首選方法，特別是對(duì)于新生兒及嬰兒患者。近期有文獻(xiàn)報(bào)道［14］，Calretinin陽性的神經(jīng)纖維可延伸至無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段。因此，臨床高度懷疑 HD而腸黏膜活檢存在Calretinin染色陽性神經(jīng)纖維時(shí)，需警惕超短段型HD可能。

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1001－7399（2017）01－0096－03

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.025

接受日期：2016－11－15

天津市兒童醫(yī)院1病理科、2新生兒外科 300134

趙 麗，女，碩士，主治醫(yī)師。Tel：（022）87787210，E-mail：719688832＠qq.com

胡曉麗，女，主任醫(yī)師，通訊作者。Tel：（022）87787208，E-mail：huxiaoli788＠126.com