大鼠腦組織高爾基染色三種制備方法的比較

王 蕾，張 芳，湯仁仙，張冠群，牛海晨

大鼠腦組織高爾基染色三種制備方法的比較

王 蕾1，張 芳1，湯仁仙1，張冠群2，牛海晨3

腦組織；高爾基染色法；冷凍切片；振動切片；石蠟切片

1873年意大利著名的神經解剖學家卡米洛·高爾基發明硝酸銀染色法，從此可以定性定量地觀察神經元的形態［1］。隨后 Cox等［2－4］對高爾基染色法的固定液和染色液進行改良，提高結果的可視性，但初學者選擇合適的染色方法仍較為困難。本實驗采用相同的固定、染色和顯色液，采用不同的制作方法（冷凍切片、石蠟切片、振動切片）進行大鼠腦組織高爾基染色，比較三種制作方法各自的優缺點，為科研實驗和制作典型的教學示教切片提供可選方法。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠 3只，體重220～240 g，實驗操作經徐州醫科大學動物倫理審查委員會批準。

1.2 取材首先SD大鼠經10%水合氯醛（國藥30037516）腹腔注射進行常規麻醉；然后用生理鹽水灌注，去除血液直至澄清；再立刻斷頭，小心取出3個腦組織，將腦組織根據所需部位，冠狀切面修成0.5 cm厚的組織塊。

1.3 固定本實驗所采用的固定液、染色液和顯色液均來自 Genmed的高爾基快速染色試劑盒。將修好的組織塊立刻放入裝有10 m L固定液 A和10 m L固定液 B的混合液離心管中，室溫下避光浸泡、孵育2周。

1.4 制作方法（1）石蠟切片：將固定好的腦組織取出，用去離子水漂洗2次，放入裝有 70%乙醇溶液的離心管中，依次梯度乙醇脫水，70%乙醇 24 h，80%乙醇溶液8 h，95%乙醇溶液Ⅰ6 h，95%乙醇溶液Ⅱ5 h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2 h，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 15 min透明［5］。用蜂蠟和石蠟以 1∶9比例的混合蠟浸蠟、包埋后用普通石蠟切片機冠狀切片，切片厚度分別為20、40、60μm，漂片、攤片和烤片后，置于二甲苯脫蠟，梯度乙醇補水至去離子水，用濾紙吸干多余水分后，等待染色。（2）冷凍切片：2周后將組織塊取出，用去離子水漂洗2次，放入裝有30%的蔗糖溶液的離心管中，在4℃冰箱里浸泡孵育，直至組織塊沉到離心管底，將組織取出。用去離子水稍加沖洗后，滴加包埋劑OTC適量于腦組織周圍，待稍冷凍后進行冠狀切片，切片厚度分別為60、80、100μm，將切好的腦片小心貼在事先掛好膠的明膠玻片上。將貼好的玻片用去離子水漂洗3次，每次5 min。用濾紙吸干多余水分后，等待染色。（3）振蕩切片：將腦組織從固定液中取出，用去離子水漂洗2次后振蕩切片，切片厚200μm，將切好的腦片收集在裝有70%乙醇溶液的離心管中，用毛筆將所需部位的腦片撈出，小心貼在事先掛好膠的明膠玻片上，用濾紙吸干多余的70%乙醇溶液后，將貼好的玻片用去離子水漂洗3次，每次5 min。用濾紙吸干多余水分，等待染色。

1.5染色和封片在50 mL棕色滴瓶加入 10 mL去離子水，然后加入5 mL顯色液 A和顯色液 B，混勻，標記為顯色工作液（有效期限 10天），然后進行以下操作，整個染色過程應避免光照：每塊腦片小心滴加500μL顯色工作液，鋪滿整個切片樣本表面，室溫下孵育30 min，小心用濾紙吸去切片上的染色液，將切片置入去離子水中孵育1 min，用濾紙吸去切片上的去離子水，每塊腦片滴加500μL顯色工作液，鋪滿整個切片樣本表面，室溫下孵育10～30 min，期間可在顯微鏡下觀察，直至組織呈現黑色，即刻中止，避免光照。用濾紙吸去切片上的顯色工作液，將切片置入去離子水中孵育1 min，常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結果

在光學顯微鏡下觀察三種制片方法各自的染色結果并拍照。（1）石蠟切片：厚度分別為20、40、60μm，神經元數量依次增加，背景干凈呈淡黃色，神經細胞的胞體及樹突、軸突皆呈黑色或黑紅色。大鼠大腦皮質6層結構層次顯示不夠清晰，錐體細胞主樹突顯示逐漸完整，樹突數量逐漸增多，軸突逐漸顯現，可見星形膠質細胞（圖1）。（2）冷凍切片：厚度分別為60、80、100μm，神經元數量依次增加，背景干凈呈淺黃色，神經細胞的胞體及樹突、軸突皆呈黑色或黑紅色。大鼠大腦皮質6層結構逐漸清晰明顯，錐體細胞主樹突、樹突和軸突逐漸顯示完整，星形膠質細胞也漸漸顯示完整（圖2）。（3）振蕩切片：厚度分別為200、1 000μm，神經元數量豐富，背景干凈呈黃色，神經細胞的胞體及樹突、軸突皆呈黑色或黑紅色。大鼠大腦皮質6層結構清晰明顯，錐體細胞主樹突、樹突和軸突顯示完整，樹突棘豐富，星形膠質細胞顯示完整（圖3）。

圖1 石蠟切片不同厚度的放大效果：A.20 μm；B.40μm；C.60μm

圖2 冷凍切片不同厚度的放大效果：A.20 μm；B.40μm；C.60μm

圖3 振蕩切片不同厚度的放大效果：A. 200μm；B.1 000μm

3 討論

神經組織由神經細胞和神經膠質細胞組成，神經細胞也稱為神經元［6］。大腦皮質的神經元都是多極神經元，根據細胞的形態可分為錐體細胞、顆粒細胞和梭形細胞三大類。（1）錐體細胞：數量較多，可分為大、中、小三型。胞體形似錐形，尖端發出一條較粗的頂樹突，伸向皮質表面，沿途發出許多小分支，胞體還向四周發出一些水平走向的樹突，軸突自胞體底部發出，長短不一，短的不超出所在的皮質，長的離開皮質進入白質，組成投射纖維和聯合纖維。（2）梭形細胞：數量較少，大小不一，胞體為梭形，樹突自胞體的上下兩端發出，上端樹突多伸達皮質表面。軸突從下端樹突的主干發出，其終末分支可與錐體細胞形成突觸。（3）顆粒細胞：數量最多，胞體較小，成顆粒狀。它們的軸突通常較短，終止于附近的錐體細胞或梭形細胞［7］。

大腦皮質的神經元分布，除個別區域外，一般從表面至深層依次可分為6層。（1）分子層：神經元小而少，主要由水平細胞和星形細胞構成，還有許多與皮質表面平行的神經纖維；（2）外顆粒層：主要由許多星形細胞和少量小型錐體細胞構成；（3）外錐體細胞層：較厚，由許多中、小型錐體細胞和星形細胞組成；（4）內顆粒層：細胞排列緊密、多數是星形細胞；（5）內錐體細胞層：主要由中型和大型錐體細胞組成；（6）多形細胞層：以梭形細胞為主，還有錐體細胞和顆粒細胞［7］。

無論是進行科研試驗還是制作典型的教學示教切片，觀察大腦皮質的神經細胞及其突起、大腦皮質神經元的分層，我們最常用到高爾基染色法。近年來，高爾基染色法最常用的制作方法主要有石蠟［5，8］、冷凍［9］和振蕩［10－11］。筆者對這三種方法進行比較，得出以下幾點體會：（1）用振蕩方法制作的切片，顯示大鼠大腦皮質神經元的分層效果最好，層次清晰，神經元數量多，錐體細胞主樹突、樹突和軸突顯示完整，樹突棘豐富，星形膠質細胞顯示完整，且1 000μm的切片比200μm的切片層次更清晰。（2）用石蠟方法制作的切片，背景最干凈，但是受普通輪轉切片機最大切片厚度60μm的限制，大鼠大腦皮質 6層結構層次不能清晰顯示，錐體細胞的主樹突、軸突及樹突顯示不完整，樹突棘很難顯示。星形膠質細胞顯示不完整。（3）用冷凍方法制作的切片，與石蠟切片一樣，受冷凍切片機最大切片厚度100μm的限制，大鼠大腦皮質6層結構層次清晰度介于石蠟切片和振蕩切片之間，錐體細胞的主樹突、軸突及樹突顯示較完整，樹突棘稀疏；星形膠質細胞顯示較完整。（4）石蠟切片和冷凍切片要經過脫水等過程，耗時較長，程序相對振蕩，切片復雜，且不易切出完整的切片。（5）石蠟切片厚度經常出現裂片，本實驗采用熔點在52～54℃的石蠟和熔點在54℃的蜂蠟以 9∶1的比例混合，浸蠟、包埋，以增加切片的潤滑和粘滯性，切片刀和組織塊的角度保持在10°以內，可減輕裂片的程度。大于10μm的石蠟切片切后易打卷，我們先把打卷的切片放在60℃溫水上，切片會很快展開，接著撈出放入38℃溫水上，待蠟片伸展平整后，用事先掛好膠的明膠玻片撈出，解決切片打卷后漂不開，浪費所需部位組織的問題。（6）冷凍切片也會經常出現裂片問題，把凍臺溫度控制在－17℃，箱內溫度控制在 －20℃，且腦組織涂上包埋劑 OTC后，稍凍結后開始切片，能明顯改善裂片的問題。（7）振蕩切片由于組織較厚，為了背景更加清晰，高爾基染色后可以延長低濃度乙醇溶液的脫水時間，減少高濃度乙醇溶液的脫水時間，封片時由于切片較厚，需增加中性樹膠的量才能將腦組織封固，并且能減少蓋蓋玻片時腦組織開裂。筆者認為振蕩切片制作方法觀察大鼠大腦皮質層次清晰，錐體細胞主樹突、樹突和軸突顯示完整，樹突棘豐富，星形膠質細胞顯示完整，且操作簡便，穩定性好，組織裂片率低，振動切片機屬于特殊的切片機，價格貴，有些實驗室不一定有振動切片機。

總而言之，高爾基染色法作為一種準確、可靠的神經組織染色，我們可以根據實驗室現有條件，根據科研或者教學的需要選擇不同的腦組織厚度，選擇合適的切片制作方法。

［1］ Golgi C.Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello［J］.Gazz Med Lombardia，1873，6：244－246.

［2］ Cox W.Impragnation des centralen nervensystemsmit quecksilbersalzen［J］.Arch Mikr Anat，1891，37：16－21.

［3］ Kopsch F.Erfahrungenüber die verwendung des formaldehyds bei der chromsilber-impr?gnation［J］.Anat Anz，1896，11：727.

［4］ Colonnier M.The tangential organization of the visual cortex［J］.J Anat，1964，98：327.

［5］ 康亞妮，王世忠，劉 皓，等.石蠟切片浸銀染色顯示大腦皮質神經元的Golgi改良法［J］.天津醫科大學學報，2006，12（2）：294－295.

［6］ 丁文龍，王祖承，陸欽池，等.神經、精神系統及感覺器官［M］.上海：上海交通大學出版社，2010：16.

［7］ 高英茂.組織學與胚胎學［M］.北京：高等教育出版社，2010：77.

［8］ 李 方，張新江，蘇 明，等.改良Golgi-Cox染色法在大鼠腦缺血研究中的應用［J］.西北國防醫學雜志，2002，2：85－86.

［9］ Koyama Y，Tohyama M.A modified and highly sensitive golgi-cox method to enable complete and stable impregnation of embryonic neurons［J］.JNeurosci Methods，2012，209（1）：58－61.

［10］張富興，董加強，張卓超，等.一種快速簡單顯示神經元樹突棘的Golgi-Cox法［J］.神經解剖學雜志，2009，5：497－500.

［11］Levine ND，Rademacher D J，Collier T J，etal.Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation：fast，reliablemethods formulti-assay analyses in rodentand non-human primate brain［J］.JNeurosciMethods，2013，213（2）：214－227.

R 44

：B

1001－7399（2017）01－0113－03

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.032

接受日期：2016－10－31

徐州醫學院2015年度院科研課題立項（2015Kj05）

1徐州醫科大學基礎醫學院形態學實驗教學中心、3遺傳學教研室，徐州 221004

2東南大學醫學院附屬徐州中心醫院神經內科，徐州221009

王 蕾，女，碩士，實驗師。E-mail：wawa831214＠sina. com