胰腺導管腺癌中SFRP4的表達及其臨床意義

饒 鵬，劉智華，花 榮

胰腺導管腺癌中SFRP4的表達及其臨床意義

饒 鵬1，劉智華1，花 榮2

目的探討分泌型卷曲相關蛋白4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）在胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中的表達及其臨床意義。方法在30組配對的 PDAC腫瘤組織和癌旁正常組織中，利用 RT-PCR檢測 SFRP4 mRNA表達水平。應用免疫組化SP法檢測205例 PDAC組織芯片中 SFRP4蛋白表達水平，并分析 SFRP4的表達與PDAC臨床病理特征及患者預后的關系。結果在 PDAC組織中，SFRP4的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于配對相鄰癌旁正常組織。RT-PCR檢測顯示，SFRP4 mRNA表達水平在90%（27／30）的PDAC組織中顯著增加（P＝0.007 2）。免疫組化染色結果顯示，SFRP4蛋白表達水平在56.5%（116／205）的癌組織中升高，但僅在28.8%（59／205）的癌旁組織中高表達。此外，SFRP4蛋白表達與PDAC臨床病理特征無相關性。Kaplan-Meier生存分析顯示 SFRP4高表達與患者不良預后相關（χ2＝3.467，P＝0.024）。結論SFRP4有望成為 PDAC新的預后標志物。

胰腺腫瘤；導管腺癌；分泌型卷曲相關蛋白4；預后

胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）惡性程度高，預后差，據統計在美國的5年生存率約6%；據預測2030年PDAC將躍居常見癌癥相關死亡原因的第二位［1－2］。早期診斷困難和療效不佳是 PDAC預后不良的主要原因，因此需新型生物學標志物準確預測患者的預后。分泌型卷曲相 關 蛋 白 4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）過去常被認為是 Wnt信號通路的拮抗劑，有腫瘤抑制作用。一般來說，Wnt家族通過將共激活因子 β-catenin從胞質轉運至細胞核來調節胚胎發育和身體內代謝平衡，這是經典 Wnt信號通路或者β-catenin依賴的信號通路［3－4］。在腫瘤微環境中，SFRP家族以及 SFRP4自身擁有與 Wnt配體和卷曲蛋白受體結合的能力從而防止Wnt信號激活，由此阻礙腫瘤發生、發展［5］。隨著對 SFRP家族的深入分析，越來越多的證據表明SFRP4在某些腫瘤中可能會促進腫瘤的生長和進展，并且失去原本的抑癌功能［6－7］。本實驗著重探討 SFRP4 mRNA和蛋白水平在PDAC中的表達，并分析其與臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集2002年1月～2014年6月上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院普外科收治的具有完整臨床資料，并經病理證實的205例PDAC手術切除標本，另收集30例配對的新鮮手術標本癌旁組織制作組織芯片。所有患者術前均未行放療、化療、激素治療或其他相關抗腫瘤治療。所有患者提供書面知情同意，本實驗經上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗研究倫理委員會批準，標本均經病理組織學檢查確診。

1．2 RT-PCR檢測 腫瘤和癌旁組織中總 RNA提取使用Trizol試劑和RT-PCR逆轉錄試劑盒均購自日本 Takara公司，具體操作按試劑盒說明書進行。RT-PCR使用ABI 7500實時PCR系統購自美國Appiled Biosystem公司。

1.3 免疫組化免疫組化采用 SP法［8］，購自北京中杉金橋公司。用已知的陽性標本作為陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。室溫下操作：切片脫蠟、水化；0.5 mol／L EDTA（pH 8.0）隔水高壓修復；3%H2O2溶液室溫處理10 min；非免疫血清作用10 min；加一抗（1∶50，SFRP4抗體購于 Abcam公司）37℃濕盒孵育 2 h后轉至4℃過夜；生物素標記二抗孵育30 min；鏈霉菌抗生物素蛋白氧化酶孵育30 min；用PBS工作液洗3次 ×5 min；DAB顯色5 min，自來水終止；蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

SFRP4表達根據陽性細胞的百分比評分：0～5%為0分；6%～35%為1分；36%～70%為2分；＞70%為3分；染色強度評分：無染色為 0分；淡黃色為1分；黃色為2分和棕黃色為 3分。兩者結果相乘的乘積：0～1分為（－），2～3分為（＋），4～6分為（?），＞6分為（?）；＜4分為低表達，≥4分為高表達。免疫組化結果由兩位有經驗的病理醫師采用雙盲法閱片。

1.4 統計學處理采用 SPSS 16.0和 Graph Pad Prism 5.0軟件進行統計學分析。SFRP4的表達與臨床病理特征的相關性分析采用 χ2檢驗；SFRP4的表達與患者預后的關系采用 Kaplan-Meier法并進行Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 SFRP4 mRNA在PDAC中的表達RT-PCR檢測30組配對PDAC組織標本和癌旁正常組織中SFRP4 mRNA表達水平。結果顯示：與配對癌旁正常組織相比，SFRP4 mRNA表達水平在 90%（27／30）的PDAC組織中顯著增加，兩者差異有統計學意義（P＝0.007 2，圖1）。此外，2個來源于Oncomine獨立數據庫均顯示相對于癌旁正常組織，PDAC組織中的SFRP4 mRNA表達水平均顯著增高。

圖1 30組配對樣本PDAC中SFRP4 m RNA的表達

2．2 SFRP4蛋白在 PDAC中的表達免疫組化SP法染色檢測 SFRP4蛋白在 205例配對的PDAC組織芯片中的表達，染色結果顯示：SFRP4蛋白在56.5%（116／205）的癌組織樣本中高表達，僅在28.8%（59／205）的癌旁組織中高表達（圖2）。SFRP4蛋白在 PDAC組織和癌旁組織中蛋白表達差異有顯著性（P＜0.001）。

2．3 SFRP4蛋白表達與 PDAC臨床病理特征的關系采用χ2檢驗分析SFRP4蛋白表達與PDAC臨床病理特征的關系。分析結果表明，SFRP4蛋白表達與PDAC臨床病理特征無相關性（P＞0.05，表1）。

表1 SFRP4蛋白表達與 PDAC臨床病理特征的相關性分析

圖2 A.SFRP4蛋白在PDAC中呈強陽性，SP法；B.SFRP4蛋白在癌旁組織中呈陰性，SP法

2．4 SFRP4蛋白表達與 PDAC患者預后的關系Kaplan-Meier生存分析和 Log-rank檢驗顯示 SFRP4高表達與患者不良預后有關（χ2＝3.467，P＝0.024，圖3）。除此之外，本實驗還分析SFRP4在不同臨床分期、淋巴結轉移和血管侵襲患者中的表達與生存期的關系。分析結果顯示，SFRP4高表達的PDAC患者不良預后與臨床分期、淋巴結轉移和血管侵襲相關（圖4）。此外，在單因素分析中，SFRP4蛋白表達與患者年齡、淋巴結轉移和肝轉移與患者生存期密切相關。多因素 Cox回歸分析證實，上述因素可以作為PDAC患者預后的獨立危險因素（表2）。

圖3 SFRP4的表達與PDAC患者生存期的相關性分析

圖4 SFRP4表達和生存期在PDAC中與臨床分期、淋巴結轉移和血管侵犯相關性分析 A.臨床分期（Ⅰ-Ⅱ）；B.臨床分期（Ⅲ-Ⅳ）；C.有淋巴結轉移；D.無淋巴結轉移；E.有血管侵襲；F.有血管侵襲

表2 單因素、多因素分析 PDAC患者生存預后因素

3 討論

目前，關于胰腺癌早期診斷標志物的尋找仍未取得 實 質 性進 展［9－11］。有些 文 獻報 道［12－13］SFRP家族在腫瘤的發生、發展過程中發揮抑制腫瘤的作用，然而 SFRP家族成員在表達水平和生物學功能方面細微的差異還有待確定［14－15］。SFRP4作為一個獨特的、具有多功能潛力的 Wnt信號分子在各種疾病及癌癥中成為關鍵的調節基因。本實驗對SFRP4在 PDAC中的表達及其臨床意義進行全面分析。首先檢測SFRP4在 PDAC組織中的 mRNA和蛋白表達水平，本組檢測結果和 2個獨立的來自Oncomine數據庫均證明 SFRP4 mRNA表達水平在胰腺癌組織中高于相鄰癌旁組織。免疫組化染色顯示205例 PDAC的 SFRP4蛋白水平顯著高表達；免疫組化染色結果與RT-PCR檢測一致。提示 SFRP4 在PDAC癌組織中顯著高表達，其在 PDAC中可能發揮致癌基因的功能。

本實驗進一步分析 SFRP4蛋白表達和 PDAC患者臨床病理特征之間的關系。以往的研究顯示，結腸癌中 SFRP4蛋白表達下調與不良預后相關［16］，本實驗得出與之相反的結果。SFRP4蛋白表達上調與 PDAC患者不良預后相關；與患者臨床分期、淋巴結轉移及血管侵襲無關。此外，單因素、多因素回歸分析證實 SFRP4蛋白表達可以作為 PDAC患者的獨立危險因素。

SFRP4蛋白在不同文獻報道中存在差異表達及作用，可能存在下列原因。（1）與其他SFRP家族成員相比，SFRP4表現出與卷曲蛋白受體的結構最少同源有相關性［6］。除了眾所周知的富集半胱氨酸結構域（cysteine-rich domain，CRD），位于 SFRP4 C端的神經生長因子樣結構域（netrin-like domain，NLD）可能也參與介導Wnt／β-catenin的信號通路激活［17］。（2）Suzuki等［18］通過 實 驗發 現 過表 達SFRP4對細胞質和核 β-catenin含量幾乎無影響。同時，He等［19］報道 SFRP4可能主導細胞生長不僅通過經典 Wnt信號通路，還可能通過β-catenin不依賴的非經典通路。

基因啟動子甲基化是一種重要的表觀遺傳學基因沉默機制，目前也已被確定在各種癌癥中存在于SFRP家族啟動子區域［20－21］。有趣的是，相比于其他 SFRP成員，SFRP4往往顯示較低的啟動子甲基化頻率［7，22］；但在胰腺癌中 SFRP4的精準表達水平和明確的生物學功能仍未被證實，確切的分子機制還有待實驗進一步闡明。

綜上所述，本實驗中SFRP4 mRNA和蛋白在PDAC組中高表達，并且其高表達與PDAC患者的不良預后相關。SFRP4表達可能作為新的PDAC患者預后標志物，有望成為治療 PDAC的新靶點。

［1］ Siegel R L，Miller K D，Jemal A.Cancer statistics，2016［J］. CA Cancer JClin，2016，66（1）：7－30.

［2］ Kamisawa T，Wood L D，Itoi T，Takaori K.Pancreatic cancer ［J］.Lancet，2016，388（10039）：73－85.

［3］ Clevers H，Nusse R.Wnt／beta-catenin signaling and disease［J］. Cell，2012，149（6）：1192－1205.

［4］ Clevers H.Wnt／beta-catenin signaling in developmentand disease ［J］.Cell，2006，127（3）：469－480.

［5］ MacDonald B T，Tamai K，He X.Wnt／beta-catenin signaling：components，mechanisms，and diseases［J］.Dev Cell，2009，17 （1）：9－26.

［6］ Jones SE，Jomary C.Secreted Frizzled-related proteins：searching for relationships and patterns［J］.Bioessays，2002，24（9）：811－820.

［7］ Feng H Q，Zhao W，Bentel J，et al.Expression of sFRP-4 and beta-catenin in human colorectal carcinoma.［J］.Cancer Lett，2006，231（1）：129－137.

［8］ 蔡 瑋，趙鳳輝，梁小芹，等.結直腸腺瘤及腺癌組織中FOXO1表達及其臨床意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2016，32（9）：1009－1013.

［9］ Turtoi A，Musmeci D，Wang Y，et al.Identification of novel accessible proteins bearing diagnostic and therapeutic potential in human pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.J Proteome Res，2011，10（9）：4302－4313.

［10］Sheng W，Dong M，Zhou J，et al.The clinicopathological significance and relationship of Gli1，MDM2 and p53 expression in resectable pancreatic cancer［J］.Histopathology，2014，64（4）：523 －535.

［11］Tian M，Cui Y Z，Song G H，et al.Proteomic analysis identifies MMP-9，DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients［J］.BMC Cancer，2008，8：241.

［12］Chung M T，LaiH C，Sytwu H K，etal.SFRP1 and SFRP2 suppress the transformation and invasion abilities of cervical cancer cells through Wnt signal pathway［J］.Gynecol Oncol，2009，112 （3）：646－653.

［13］Linhart H G，Lin H，Yamada Y，etal.Dnmt3b promotes tumorigenesis in vivo by gene-specific de novomethylation and transcriptional silencing［J］.Genes Dev，2007，21（23）：3110－3122.

［14］Bu X M，Zhao CH，Zhang N.Hypermethylation and aberrantexpression of secreted fizzled-related protein genes in pancreatic cancer［J］.World JGastroenterol，2008，14（21）：3421.

［15］Chung M T，Sytwu H K，Yan M D，etal.Promotermethylation of SFRPs gene family in cervical cancer［J］.Gynecol Oncol，2009，112（2）：301－306.

［16］Vilchez V，Turcios L，Marti F，Gedaly R.Targeting Wnt／betacatenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment［J］.World JGastroenterol，2016，22（2）：823－832.

［17］Perumal V，Krishnan K，Gratton E，et al.Number and brightness analysis of SFRP4 domains in live cells demonstrates vesicle association signal of the NLD domain and dynamic intracellular responses to Wnt3a［J］.Int JBiochem Cell Biol，2015，64：91－96.

［18］Suzuki H，Watkins D N，Jair KW，et al.Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer［J］.Nat Gene，2004，36（4）：417－422.

［19］He B，Lee A Y，Dadfarmay S，etal.Secreted frizzled-related protein 4 is silenced by hypermethylation and inducesapoptosis in beta-catenin-deficient human mesothelioma cells［J］.Cancer Res，2005，65（3）：743－748.

［20］Goeppert B，Konermann C，SchmidtCR，etal.Global alterations of DNA methylation in cholangiocarcinoma target theWnt signaling pathway［J］.Hepatology，2014，59（2）：544－554.

［21］Jost E，Gezer D，Wilop S，et al.Epigenetic dysregulation of secreted frizzled-related proteins in multiple myeloma［J］.Cancer Lett，2009，281（1）：24－31.

［22］Zeng G，Germinaro M，Micsenyi A，et al.Aberrant Wnt／betacatenin signaling in pancreatic adenocarcinoma［J］.Neoplasia，2006，8（4）：279－289.

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Expression and clinical significance of SFRP4 in pancreatic ductal adenocarcinoma

RAO Peng1，LIU Zhi-hua1，HUA Rong2
（1Department of Hepatobiliary Surgery，Yingtan People’s Hospital，Yingtan 335000，China；2Department of Billary-Pancreatic Surgery，Renji Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200127，China）

PurposeTo investigate the expression of secreted frizzled-related protein 4（SFRP4）and to evaluate its clinical significance in pancreatic ductal adenocarcinoma（PDAC）.M ethodsRT-PCR was performed to analyze SFRP4 mRNA expression level in 30 paired PDAC lesion and matched adjacent non-tumor tissue.Immunohistochemistry staining detection of 205 matched cases tissue microarray was conducted to explore SFRP4 protein expression pattern.The correlation between SFRP4 and clinical characteristics was also analyzed，including overall survival.ResultsSFRP4 expression pattern both at mRNA and protein level in PDAC lesion was higher than that in matched adjacent non-tumor tissue.AtmRNA level，to found that expression of SFRP4 was elevated in 90% （27／30）of PDAC tissues（P＝0.007 2）.To found that high expression of SFRP4 was detected in 56.5% （116／205）of PDAC tissue，while only 28.8% （59／205）in the adjacent non-tumor tissue. Moreover，no significant association was observed between SFRP4 expression and clinical characteristics.Kaplan-Meier survival analysis showed high level of SFRP4 expression was correlated with poor overall survival（χ2＝3.467，P＝0.024）.ConclusionSFRP4 can be a novel prognostic biomarker in PDAC.

pancreatic neoplasm；dutcal adenocarcinoma；secreted frizzled-related protein 4；prognosis

R 735.9

：A

1001－7399（2017）01－0073－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.018

接受日期：2016－11－28

1江西省鷹潭市人民醫院普外科 3350002上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院膽胰外科，上海200127

饒 鵬，男，碩士研究生。E-mail：16274196＠qq.com 花 榮，男，博士，副主任醫師，通訊作者。E-mail：

18817821432＠126.com