APE1/Ref-1、EGR-1在食管鱗癌中的表達及相關性研究

韓立杰 董稚明 劉偉 魏冬冬

APE1/Ref-1、EGR-1在食管鱗癌中的表達及相關性研究

韓立杰 董稚明 劉偉 魏冬冬

目的 本研究旨在明確APE1/Ref-1和EGR-1在食管鱗癌及癌旁組織中的表達情況，并結合臨床資料評估其表達與組織分級和臨床分期之間的關系，為進一步研究食管鱗癌的發生發展機制提供參考依據，并為食管鱗癌的預防、診治提供臨床指標。方法 隨機選取2009至2010年接受胸外科手術治療的86例食管癌標本，術前均未經放化療等任何抗癌治療。采用免疫組織化學法(S-P法)測定APE1/Ref-1的蛋白、EGR-1的蛋白表達情況，對其相關性進行分析。結果 APE1/Ref-1 在ESCC組織中細胞質和細胞核聯合陽性表達率為68.6%明顯高于癌旁組織的聯合陽性表達率8.1%，差異有統計學意義(P<0.01)。APE1/Ref-1在癌旁組織中的細胞核陽性表達率為91.9%明顯高于ESCC組織的24.4%，差異有統計學意義(P<0.01)。EGR-1在ESCC組織的陽性表達率顯著低于癌旁組織(P<0.01)。結論 在ESCC中，APE1/Ref-1胞核胞質聯合表達率隨著組織學分級降低和臨床分期的升高有增強的趨勢，EGR-1的陽性表達率隨著組織學分級降低和臨床分期的升高有降低的趨勢。

APE1/Ref-1;EGR-1;免疫組織化學;食管鱗狀細胞癌

脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子1(apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1，APE1/Ref-1)是一種多功能因子，在多種生物學反應中起著非常重要的作用。研究表明APE1/Ref-1的表達同腫瘤的發生發展有一定的關系，然而此基因與腫瘤相關性的研究主要集中于結直腸癌、腎癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌和骨肉瘤等領域[1-12]。關于APE1/Ref-1與食管鱗癌之間關系的研究國內外鮮有文獻報道。早期生長反應基因1(early growth response gene-1，EGR-1)為即刻早期反應基因家族成員之一，它能調控其下游靶基因的轉錄和表達，并且在細胞增殖與凋亡的過程中發揮重要作用。許多腫瘤的發生發展都與此基因的的異常表達密切相關。有關EGR-1在食管鱗癌發生發展中的作用的研究還很少，值得進一步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫科大學第四醫院2009至2010年接受胸外科手術治療的86例食管癌標本，男63例，女23例；年齡18～70歲，平均年齡(42±3)歲。依據國際抗癌聯盟食管癌TNM分期(2009)：Ⅰ、Ⅱ期47例，Ⅲ、Ⅳ期39例；組織類型均為鱗癌；高中分化55例，低分化31例。

1.2 主要試劑與方法 APE1/Ref-1鼠抗人單克隆抗體，購自美國abcam生物技術公司，EGR-1兔抗人多克隆抗體購自美國 SANTA CRUZ 生物技術公司，SP9001兔SP檢測試劑盒、SP9002鼠SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，OLYMPUSBX41光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，Q capture圖像采集系統購自加拿大QIMAGING公司。采用免疫組織化學法(S-P法)測定APE1/Ref-1的蛋白、EGR-1的蛋白表達情況。食管癌組織標本制成4 μm連續切片，常規脫蠟至水后，同一條件下進行SP法免疫組化染色。

1.3 結果判定 光學顯微鏡下觀察并計數，APE1/Ref-1蛋白表達陽性產物呈棕黃色細顆粒狀，有3種細胞內表達模式，分別為細胞核、細胞質、細胞核和細胞質，出現這三種表達的任一種都參加計數，分別記為細胞核表達、細胞質表達和細胞核和細胞質雙表達。EGR-1蛋白為細胞核表達，以胞核內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色細胞。采用雙盲法：隨機選取10個高倍鏡視野計數至少500～1 000個鱗狀上皮細胞或腫瘤細胞觀察其中陽性細胞的染色深淺和占計數細胞的百分比進行評分。評分方法：(1)按細胞染色有無及深淺對染色強度評分：0分為無色，2分為黃色或深黃色，3分為褐或棕褐色；(2)按陽性細胞所占的百分比評分：0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為≥75%。每例染色積分=兩種評分相乘(A×B)，積分≥3分為陽性；積分<3為陰性。

2 結果

2.1APE1/Ref-1在食管鱗癌中的表達 在癌旁組織中APE1/Ref-1的細胞核陽性表達率(91.9%，79/86)明顯高于鱗癌組織(24.4%，21/86)，差異有統計學意義(P<0.01)。鱗癌組織中細胞質和細胞核聯合陽性表達率(68.6%，59/86)明顯高于癌旁組織的聯合陽性表達率(8.1%,7/86)，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 鱗癌組織和瘤旁組織的APE1/Ref-1蛋白表達 n=86,例(%)

2.2EGR-1在食管鱗癌中的表達EGR-1蛋白的陽性表達定位于胞核，未見細胞質表達。鱗癌組織的陽性表達率(39.5%，34/86)顯著低于癌旁組織(93.0%，80/86)。差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 鱗癌組織和癌旁組織的EGR-1蛋白表達 n=86,例(%)

2.3APE1/Ref-1的表達與臨床參數的關系 在86例食管癌組織中APE1/Ref-1蛋白胞核胞質聯合表達陽性率按組織分級和臨床分期的不同進行統計學分析，低分化組的陽性率(87.1%,27/31)明顯高于高中分化組的陽性率(54.5%,30/55)，差異有統計學意義(P<0.05)。APE1/Ref-1的胞核胞質聯合表達與組織學分級呈負相關。臨床Ⅲ、Ⅳ期組的陽性表達率(87.2%,34/39)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組的陽性表達率(66.0%,31/47)(P<0.05)。APE1/Ref-1的胞核胞質聯合表達與臨床分期呈正相關。按性別和年齡分組，APE1/Ref-1的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4APE1/Ref-1和EGR-1在ESCC中表達的相關性 在21例APE1/Ref-1胞核表達的食管鱗癌組織中，有13例EGR-1表達陽性，而在65例APE/Ref-1非胞核表達的食管鱗癌組織中，僅有21例EGR-1表達陽性，即EGR-1在APE1/Ref-1胞核表達的ESCC組織中的陽性表達率(61.9%)顯著高于其在APE1/Ref-1非胞核表達的ESCC組織中的陽性表達率(32.3%)，差異有統計學意義(P<0.05)，二者呈明顯的相關性(r=0.260)。見表4。

表3 食管鱗癌組織中APE1/Ref-1聯合表達與臨床的關系 例(%)

2.5 EGR-1的表達與臨床參數的關系 在86例食管鱗癌中，EGR-1的陽性表達情況按組織學分級和臨床分期的不同進行分析，低分化組的陽性率(22.6%,7/31)明顯低于高分化組的陽性率(49.1%,27/55)，差異有統計學意義(P<0.05)。EGR-1的陽性表達與組織學分級呈正相關。EGR-1在臨床Ⅲ、Ⅳ期組的陽性表達率(25.6%,10/39)明顯低于Ⅰ、Ⅱ期組的陽性表達率(51.1%,24/47)，差異有統計學意義(P<0.05)。EGR-1的陽性表達與臨床分期呈負相關。按性別和年齡分組，EGR-1的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 食管鱗癌組織中APE1/Ref-1和EGR-1的關系 例

表5 食管鱗癌組織中EGR-1表達與臨床的關系 例(%)

3 討論

APE1/Ref-1廣泛表達于多種組織細胞中。APE1/Ref-1 是一種多功能因子。首先，它可以通過改變多種轉錄因子的氧化還原狀態，而調控這些轉錄因子的活性，其次，它還是DNA堿基切除修復過程中的主要限速酶[13,14]。APE1/Ref-1蛋白表達的多少與DNA修復活性相一致，許多病理生理過程，例如腫瘤形成、細胞凋亡等，都與這種基因的異常表達、異常分布或功能改變密切相關[15，16]。

有研究發現，在惡性黑色素瘤、直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、前列腺癌中[7，11]，癌細胞中的APE1/Ref-1細胞質表達或細胞核胞質共同表達都與腫瘤的惡性度呈正相關。這些研究與我們的試驗結果一致：APE1/Ref-1在食管鱗癌癌旁組織中的細胞核表達率(91.9%)明顯高于鱗癌組織(24.4%)，鱗癌組織中胞核胞質聯合表達率(68.6%)明顯高于癌旁組織的聯合表達(8.1%)，以上差異具有顯著性(P<0.01)。這說明APE1/Ref-1在正常組織中大部分為核定位表達，但隨著細胞惡變為腫瘤細胞后，APE1/Ref-1在胞質中的表達強度明顯增加。這些結果表明此基因蛋白的胞核胞質聯合定位可能與食管鱗癌的發生有關。APE1/Ref-1胞核胞質聯合表達在低分化食管鱗癌組中的陽性率明顯高于高中分化組，差異具有顯著性(P<0.05)，聯合表達率與組織學分級呈負相關。胞核胞質聯合表達在臨床Ⅲ、Ⅳ期中的陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期的陽性率，差異具有顯著性(P<0.05)，聯合表達率與臨床分期呈正相關；按性別和年齡分組，APE1/Ref-1的胞核胞質聯合表達無顯著性差異(P>0.05)。APE1/Ref-1胞核胞質聯合表達率隨著組織學分級降低和臨床分期的升高有增強的趨勢。提示此基因蛋白的胞核胞質聯合表達可能與食管鱗癌的發展有關。由此可見，APE1/Ref-1在食管鱗癌中的發生發展中可能發揮著重要作用，因此可以用它來判斷腫瘤發生發展情況及預后。

EGR-1屬于即刻早期反應基因家族成員，與細胞的增殖、分化和凋亡有關的多種基因都是EGR-1作用的靶基因[17]。有研究指出,EGR-1可能是通過激活一些抑癌基因(P53基因等)、介導腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或者改變細胞內鈣離子的濃度來實現其誘導細胞凋亡的作用的[18,19]。EGR-l在細胞增殖和細胞凋亡過程中均有調控作用，兩種截然相反的作用具體發揮哪種主要還在于所調控蛋白的表達情況[20]。有文獻表明，在c-Jun蛋白、野生型P53蛋白或PTEN蛋白任何一種蛋白高表達的情況下，EGR-1的主要作用為誘導細胞凋亡；在突變型P53蛋白高表達的情況下，EGR-1的主要作用為促進細胞增殖[21,22]。

許多腫瘤的發生發展都與此基因的異常表達密切相關。Aggarwal等[23]研究表明用不同劑量的Co60射線照射宮頸癌Hela細胞株后，EGR-1基因表達隨照射量的增加而增加,EGR-1基因的蛋白表達量與Hela細胞株的凋亡率呈正相關。Lee等[24]研究結果顯示，用托滅酸誘導結直腸癌細胞中EGR-1的表達增加后，腫瘤生長受抑。李曉斌等[25]用RT-PCR的方法檢測食管癌患者EGR-1mRNA表達情況發現，EGR-1mRNA在食管癌組織的表達明顯低于癌旁組織。此基因的表達與腫瘤分化程度和臨床分期也有關，分化程度越低，表達也越低，臨床分期越晚，表達也越低。其表達與年齡性別無關。這與我們的試驗結果也基本一致：EGR-1基因在癌旁組織的蛋白表達率明顯高于食管鱗癌組織(P<0.05)，低分化食管鱗癌組的陽性表達率明顯低于高中分化組 (P<0.05)，EGR-1的陽性表達隨著組織學分級的降低而降低；EGR-1在臨床Ⅲ、Ⅳ期中的表達明顯低于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，EGR-1的陽性表達隨著臨床分期的推遲而降低；按性別和年齡分組，EGR-1的表達無顯著性差異(P>0.05)。這表明EGR-1在食管鱗癌中的表達降低與組織學分級、臨床分期密切相關。我們推測EGR-1蛋白的表達降低是導致食管鱗癌發生發展的重要原因之一。

然而還有一些相反的結論。EGR-1與胃癌、膀胱癌、前列腺癌發生發展有關系，并且是正相關[20，25,26]。由于EGR-1對腫瘤的調節具有雙向性，所以還存在很多問題需要解決，例如，它對哪些腫瘤的發生發展是正向調節，對那些腫瘤是負向調節，以及它對腫瘤細胞的生長抑制或促進作用都是通過調控哪些下游基因實現的等等還有待于進一步研究。

另外，我們還發現在21例APE1/Ref-1胞核表達的鱗癌組織中，有13例EGR-1蛋白表達陽性，而在65例APE1/Ref-1非胞核表達的鱗癌組織中，僅有21例EGR-1表達陽性，即EGR-1在APE1/Ref-1胞核表達的鱗癌組織中的陽性表達率顯著高于其在APE1/Ref-1非胞核表達的鱗癌組織中的陽性表達率(P<0.05)，二者呈明顯的相關性(相關系數r=0.260)。推測兩種基因在食管鱗癌的發生過程中相互影響，其共同作用可能與食管鱗癌的發生有關。但是兩種基因間相互影響的機制及其在食管鱗癌發生中的具體作用還不清楚，值得進一步研究。

1 仲召陽，王東，李增鵬，等.骨肉瘤中APE1的表達及其與血管生成的關系.第三軍醫大學學報,2005，27:1045-1048.

2ZielKA,CampbellCC,WilsonGL,etal.Ref-l/Apeiscriticalforformationofthehypoxia-inducibletranscriptionalcomplexonthehypoxicresponseelementoftheratpulmonaryarteryendothelialcellVEGFgene.FasebJ,2004,18:986-988.

3 呂嘉春，何敏，廖永德，等.氧化/還原因子ref-1在肺癌組織中的細胞定位表達及與8-0H-DG的關系.腫瘤,2004,24:35-37.

4 周亞燕,楊東,李先明.APE/Ref-1和CAⅨ在頭頸部腫瘤中表達的臨床意義.實用醫學雜志,2008,24:868-870.

5 張奎美,紀新強,徐平平.卵巢上皮性癌中APE/Ref21的表達及與VEGF和MVD的關系.腫瘤基礎與臨床,2009,22:11-14.

6 陸進成，錢普東，查文武.食管癌根治術后預防性放射治療隨機研究的Meta分析.循證醫學,2005,5:166-171.

7YangS,IraniK,HeffronSE,etal.Alterationsintheexpressionoftheapurinic/apyrimidinicendonuclease-1/redoxfactor-1 (APE/Ref-1)inhumanmelanomaandidentificationofthetherapeuticpotentialofresveratrolasanAPE/Ref-1inhibitor.MolCancerTher,2005,4:1923-1935.

8KimJS,KimJM,LiangZL,etal.Prognosticsignificanceofhumanapurinic/apyrimidinicendonuclease(APE/Ref-1)expressioninrectalcancertreatedwithpreoperativeradiochemotherapy.IntJRadiatOncolBiolPhys,2012,82:130-137.

9ShengQ,ZhangY,WangR,etal.PrognosticsignificanceofAPE1cytoplasmiclocalizationinhumanepithelialovariancancer.MedOncol,2012,29:1265-1271.

10YooDG,SongYJ,ChoEJ,etal.AlterationofAPE1expressioninnon-smallcelllungcancer:theimplicationsofimpairedextracellularsuperoxidedismutaseandcatalaseantioxidantsystems.LungCancer,2008,60:277-284.

11KelleyMR,ChengL,FosterR,etal.ElevatedandalteredexpressionofthemultifunctionalDNAbaseexcisionrepairandredoxenzymeAPE1/Ref-1inprostatecancer.ClinCancerRes,2001,7:824-830.

12PuglisiF,BarboneF,TellG,etal.PrognosticroleofAPE/Ref-1subcellularexpressioninstageI-IIIbreastcarcinomas.OncolRep,2002,9:11-17.

13 封亮，邵福源.無嘌呤無嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子1的研究進展.第二軍醫大學學報,2003，2:214-217.

14TellG,DamanteG,CaldwellD,etal.TheintracellularlocalizationofAPE1/Ref-1:morethanapassivephenomenon.AntioxidRedoxSignal,2005,7:367-369.

15ZouGM,MaitraA.Small-moleculeinhibitoroftheAPendonuclease1/REF-lE3330inhibitspancreaticcancercellgrowthandmigration.MolCancerTher,2008,7:2012-2021.

16ZouGM,KarikariC,KabeY,etal.TheApe-1/Ref-1redoxantagonistE3330inhibitsthegrowthoftumorendotheliumandendothelialprogenitorcells:therapeuticimplicationsintumorangiogenesis.JCellPhysiol,2009，219:209-218.

17 李曉斌,房定珠,桂衛星,等.食管癌組織早期生長反應基因-lmRNA表達與患者生存期關系的研究.中國綜合臨床,2008,24:524-526.

18AhmedMM,SellsSF,VenkatasubbaraoK,etal.Ionizingradiation-inducibleapoptosisintheabsenceofp53linkedtotranscriptionfactorEGR-1.JBiolChem,1997,272:33056-33061.

19WoroniczJD,CalnanB,NgoV,etal.RequirementfortheorphansteroidreceptorNur77inapoptosisofT-cellhybridomas.Nuture,1994,367:277-281.

20KobayashiD,YamadaM,KamagataC,etal.Overexpressionofearlygrowthresponse-1asametastasis-regulatoryfactoringastriccancer.AnticancerRes,2002,22:3963-3970.

21BaronV,DussS,RhimJ,etal.Antisensetotheearlygrowthresponse-1gene(Egr-1)inhibitsprostatetumordevelopmentinTRAMPmice.AnnNYAcadSci,2003,1002:197-216.

22WeiszL,ZalcensteinA,StambolskyP,etal.TransactivationoftheEGRlgenecontributestomutantp53gain0ffunction.CancerRes,2004,64：8318-8327.

23AggarwalBB,BhardwaiA,AggarwalRS,etal.Roleofresveratrolinpreventionandtherapyofcancer:preclinicalandclinicalstudies.AnticancerRes,2004,24:2783-2840.

24LeeSH,BahnJH,ChoiCK,etal.ESE-1/EGR-lpathwayplaysaroleintolfenamicacid-inducedapoptosisincolorectalcancercells.MolCancerTher,2008,7:3739-3750.

25 李曉斌,房定珠,張軍，等.食管癌組織EGR-1基因表達及與臨床病例的關系.腫瘤防治雜志,2005,12:675-678.

26EgerodFL,NielsenHS,IversenL,etal.Biomarkerforearlyeffectsofcarcinogenicdual-actingPPARagonistsinraturinarybladderurotheliuminvivo.Biomarkers,2005,10:295-309.

27GitenayD,BaronVT.IsEGR1apotentialtargetforprostatecancertherapy.FutureOncol,2009,5:993-1003.

Expression and correlation of APE1/Ref-1,EGR-1 in esophageal squamous cell carcinoma

HANLijie*,DONGZhiming,LIUWei,etal.

*DepartmentofRadiotherapy,CentralHospitalofCangzhouCity,Hebei,Cangzhou061000,China

Objective To observe the expressions of apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1(APE1/Ref-1) and early growth response gene-1(EGR-1) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and in adjacent non-cancerous tissues,and to analyze the correlation between the expressions and clinical grading as well as clinical staging in order to provide reference basis for the researches about the pathogenesis and development of ESCC and to provide clinical indexes for prevention and treatment of ESCC.Methods Eighty-six cases of fresh specimens of ESCC and adjacent non-cancerous tissues that were collected from 2009 to 2010 were enrolled in the study.All the patients with ESCC were not treated by chemoradiotherapy before operation.The expression levels of APE1/Ref-1 and EGR-1 were detected by immunohistochemistry (SP).Results The positive expression rate of APE1/Ref-1 in ESCC tissues (cell nucleus and cytoplasm) was significantly higher than that in adjacent non-cancerous tissues (68.6% vs 8.1%,P<0.01).The positive expression rate of APE1/Ref-1 in adjacent non-cancerous tissues (cell nucleus) was significantly higher that in ESCC tissues (91.9% vs 24.4%,P<0.01).HoweverthepositiveexpressionrateofEGR-1inESCCtissueswassignificantlylowerthanthatinadjacentnon-canceroustissues(P<0.01).Conclusion The combination expression rates in cell nucleus and cytoplasm of ESCC tissues are incresaed with the decrease of histological grade and the increase of clinical stage,however, the positive expression rates of EGR-1 are decresaed with the decresae of histological grade and the increase of clinical stage of ESCC.

APE1/Ref-1;EGR-1;immunohistochemistry;esophageal squamous cell carcinoma

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.05.008 ·論著·

061000 河北省滄州市中心醫院放療科(韓立杰、魏冬冬)，腫瘤外三科(劉偉)；河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所(董稚明)

R 735.1

A

1002-7386(2017)05-0671-04

2016-10-10)