阿司匹林丁香酚酯的一代繁殖毒性研究

趙曉樂，孔曉軍，楊亞軍，劉希望，李世宏，秦哲，焦增華，李劍勇(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/農業部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

阿司匹林丁香酚酯的一代繁殖毒性研究

趙曉樂，孔曉軍，楊亞軍，劉希望，李世宏，秦哲，焦增華，李劍勇*
(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/農業部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

為了初步評價阿司匹林丁香酚酯(AEE)對親代大鼠的生殖功能和子代早期發育的影響，將360只Wistar大鼠隨機分成6組，分別為受試藥物AEE高、中、低劑量組(劑量分別為498.0、124.5和31.1 mg·kg-1·d-1)，阿司匹林組(劑量為68.4 mg·kg-1·d-1)，丁香酚組(劑量為246.0 mg·kg-1·d-1)，空白對照組(給予常規維持飼料)。各實驗組均按設定劑量連續給藥10周后，測定親代大鼠主要的臟器系數、繁殖指數和生產指標以及子代(F1)仔鼠的出生指標和生長指標。結果顯示，與空白對照組相比，高劑量的AEE影響胎鼠的生長(P<0.05)，并且高劑量AEE組大鼠的妊娠率、窩產仔數、出生活仔率和出生存活率都偏低，其中雄性仔鼠比例偏高；阿司匹林組妊娠大鼠和哺乳期胎鼠生長緩慢(P<0.05)；高劑量組AEE親代大鼠的睪丸和附睪系數偏高(P<0.05)，阿司匹林和丁香酚組子代大鼠的附睪系數偏高(P<0.05)。結果表明，在本試驗條件下，AEE對大鼠繁殖毒性的最大無損害作用劑量為31.1 mg·kg-1·d-1，對大鼠的最小有損害作用劑量為124.5 mg·kg-1·d-1。

阿司匹林丁香酚酯；生殖毒性；發育毒性；繁殖指標

阿司匹林丁香酚酯(Aspirin eugenol ester, AEE)由阿司匹林(Aspirin)與丁香酚(Eugenol)經過酰氯反應合成的一種新型的無色透明藥用化合物。前期研究表明AEE一方面可降低Aspirin對胃腸道的刺激性，另一方面又可增強Eugenol的穩定性，同時臨床作用的結構部位不會發生改變[1]。藥理學研究表明，等劑量的AEE對二甲苯致大鼠耳廓腫脹模型的抗炎效果與Aspirin相當，在酵母菌致大鼠發熱模型中，AEE的解熱效果與等劑量的Aspirin無顯著差異，但AEE的藥效更持久。此外，AEE還具有鎮痛、抗氧化、抑制血小板聚集、降低血脂等生物活性[2-4]。藥代動力學研究發現，AEE在體內首先分解代謝為水楊酸和Eugenol，進而水楊酸和Eugenol均進行二相代謝轉化生成水楊酸的葡萄糖醛酸結合物、水楊酸的甘氨酸結合產物和Eugenol的葡萄糖醛酸結合物和Eugenol的硫酸結合產物，并且這些代謝產物在血漿和尿液中都可以檢測到[5]。毒理學研究表明，AEE對小鼠經口急性毒性的半數致死量(LD50)為10.39 mg/kg，大鼠經口急性毒性的LD50是5.98 mg/kg，而前藥Aspirin和Eugenol的大鼠急性經口毒性分別為1.93 mg/kg和1.5 mg/kg[6]，說明AEE相比前體藥物毒性更低。由于合成AEE的前藥Aspirin是研究藥物致畸作用的陽性對照藥物，而AEE在體內分解為Aspirin和Eugenol，因此，AEE是否具有繁殖毒性值得研究。目前未見AEE的繁殖毒性研究報道，因此本實驗就AEE對妊娠大鼠、胚胎及子代發育是否有影響進行了研究。

1 材料與方法1.1 藥物與試劑 AEE(純度>99%，HPLC方法檢測)，中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所制備；Aspirin，武漢合中化工制造有限公司，純度>99.9%；Eugenol，江西匯通藥用香料油有限公司，純度>99%；吐溫-80，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗動物 6周齡、未經產的Wistar大鼠360只，體重200 g±20 g，隨機分為6組，每組60只，雌雄各半。飼養溫度為22±3 ℃[7]，相對濕度60%±10%，光暗周期12 h。

1.3 實驗方法 將AEE設為低、中、高三個劑量組(劑量分別為31.1、124.5和498.0 mg/kg)，即L(AEE)、M(AEE)和H(AEE)。Eugenol組的給藥劑量為246.0 mg/kg，與H(AEE)組的劑量等摩爾。Aspirin給藥組的劑量為68.4 mg/kg，與M(AEE)組的劑量等摩爾。AEE和Aspirin研磨后過100目篩，按劑量比例將其加入到飼料中(福貝世亨生物醫藥(上海)有限公司成)飼喂大鼠。Eugenol與吐溫-80按1∶2質量比配制成混懸液，以飲水方式給予大鼠。

親代大鼠飼喂10周后，雌雄比按1∶1進行同籠交配。計算繁殖指數：受孕率(受孕率=懷孕大鼠數/交配雌性大鼠數×100%)、妊娠率(妊娠率=分娩有活體幼仔的大鼠數/懷孕大鼠數×100%)、出生活仔率(出生活仔率=出生時活的仔鼠數/出生時仔鼠總數×100%)、出生存活率(出生存活率=產后4 d仔鼠存活數/出生時活仔數×100%)、哺乳存活率(哺乳存活率=21 d斷乳時仔鼠存活數/出生4 d后仔鼠存活數×100%)、性別比(性別比=仔鼠成熟時雄鼠數/雌鼠數)。

測定生產指標：每窩產仔數，仔鼠出生后第0、4、7和21天的生長變化。實驗結束時解剖實驗動物，測定親代和子代大鼠睪丸和附睪(或子宮和卵巢)的臟器系數[8-10]。

臟器系數=臟器重量/體重×1000

2 結 果2.1 臨床表現 除H(AEE)和Aspirin組大鼠的活動和進食略減，被毛疏松外，其余親代和F1代對照組大鼠在整個試驗期間精神狀態良好，活動正常，進食、飲水和皮毛均無明顯的異常變化。

2.2 妊娠大鼠體重變化 與空白對照組比較，Eugenol組、M(AEE)組和L(AEE)組的孕鼠體重增長無差別(P>0.05)；H(AEE)組和Aspirin組的孕鼠體重增長緩慢，有統計學意義(P<0.05)，結果見圖1。

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 各劑量組妊娠大鼠體重增長曲線

2.3 繁殖指數 如表1所示，Eugenol組大鼠的受孕率偏低，H(AEE)組大鼠的妊娠率、出生活仔率和出生存活率偏低，其中性別比例很異常，雄性仔鼠比例偏高。

表1 各劑量組大鼠的繁殖指標

與空白對照組比較，*P<0.05, 差異顯著

2.4 生長指標 各劑量組的窩產仔數和死亡數如圖2所示。窩產仔數是大鼠分娩后第一天平均窩產仔鼠，可見H(AEE)組和Aspirin組大鼠的窩產仔鼠明顯偏低(P<0.05)。F1代哺乳期時體重生長見圖3，與對照組對比，H(AEE)、M(AEE)和Aspirin組子代大鼠生長緩慢，具有統計學意義(P<0.05)。H(AEE)組子代體重增長最為緩慢，但M(AEE)組子代生長狀況明顯好于Aspirin組。

2.5 臟器系數 F1代斷乳20 d后，親代大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，心臟采血后脫臼處死，雌性大鼠分離子宮和卵巢，雄性大鼠分離睪丸和附睪，分別進行稱重計算臟器指數，結果見表2。與空白對照組相比，H(AEE)組親代大鼠的附睪和睪丸的臟器系數偏高(P<0.05)。F1代斷乳后給空白飼料飼喂三個月后，Aspirin和Eugenol處理組大鼠的子代附睪的系數偏高(P<0.05)。

3 討論與小結

AEE的劑型研究還正在進行當中，本試驗中將AEE作為原料藥直接添加到大鼠飼料中，通過飼喂的方式給予大鼠。各劑量組妊娠大鼠體重增長與空白對照組比較，H(AEE)組和Aspirin組妊娠大鼠的體重增長緩慢，與溶劑對照組相比差異顯著(P<0.05)。這表明高劑量的AEE和Aspirin對胎鼠生長發育有一定影響，這與AEE在體內分解為水楊酸和丁香酚有關。與Aspirin組等摩爾的M(AEE)組與空白對照組相比差異不顯著，表明AEE對妊娠大鼠產生的毒性比Aspirin小。

與空白對照組比較，*P <0.05，**P <0.01圖2 各劑量組親代大鼠的每窩產仔數

與空白對照組比較，*P <0.05，**P <0.01圖3 各劑量組F1代大鼠哺乳期的體重增長

表2 各劑量組親代和F1代大鼠的主要生殖臟器系數

與空白對照組比較，*P<0.05, 差異顯著

各受試藥物組大鼠的妊娠率、窩產數、出生活仔率、出生存活率、哺乳存活率、性別比、仔鼠的哺乳期生長等指標與空白對照組比較，結果得出：與溶劑對照組相比，H(AEE)組大鼠妊娠率、窩產數、出生活仔率、出生存活率、哺乳存活率和哺乳期仔鼠的體重增長都偏低，而雄/雌性別比偏高，這表明當AEE為498.0 mg/kg時，會對大鼠的生殖和發育產生影響，導致大鼠的繁殖能力和哺乳能力較弱。Eugenol的劑量為246.0 mg/kg時會降低大鼠的受孕率，說明Eugenol可能影響合子形成或著床[11]。M(AEE)組和L(AEE)組的繁殖指標與空白對照組相比差異不明顯。

試驗結束時，對雌性大鼠子宮和卵巢，雄性大鼠睪丸和附睪的臟器指數進行統計分析，H(AEE)組親代大鼠的睪丸和附睪臟器系數偏高，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)，可見長期接觸高劑量的AEE，會對大鼠的睪丸和附睪產生影響[12]。F1代大鼠飼喂空白飼料三個月后，對其睪丸、附睪、子宮和卵巢進行統計學分析，只有Aspirin組和Eugenol組F1代大鼠的附睪的臟器指數偏高(P<0.05)，說明Aspirin和Eugenol可能會對子代雄性大鼠的生殖系統產生不良影響，這需要進一步探討。

以上分析結果表明，498.0 mg·kg-1·d-1劑量的AEE會造成大鼠繁殖指數異常，影響胚胎的發生及胎兒的發育，導致自然流產和胎兒發育遲緩。因此，在本實驗的條件下，AEE對大鼠繁殖毒性的最大無損害作用劑量為31.1 mg·kg-1·d-1，對大鼠的最小有損害作用劑量為124.5 mg·kg-1·d-1，并且Aspirin繁殖毒性最大，AEE次之，Eugenol的繁殖毒性最小。此外Aspirin和Eugenol有可能影響后代的生殖系統。

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(編輯：李文平)

Reproductive Toxicity in Parental Generation of Aspirin Eugenol Ester on Rats

ZHAO Xiao-le, KONG Xiao-jun, YANG Ya-jun, LIU Xi-wang, LI Shi-hong, QIN Zhe, JIAO Zeng-hua, LI Jian-yong*
(KeyLabofNewAnimalDrugProject,GansuProvince;KeyLabofVeterinaryPharmaceuticalDevelopment,MinistryofAgriculture;LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciencesofCAAS,Lanzhou730050,China)

The reproductive and developmental toxicity of aspirin eugenol ester (AEE) in rats were investigated. Parental generation were exposed to AEE at doses of 498.0、124.5 and 31.1 mg·kg-1·d-1and aspirin at dose of 68.4 mg·kg-1·d-1and eugenol at dose of 246.0 mg·kg-1·d-1for 10 weeks before breeding. The weights of main organs and breeding indexes were observed in P and first filial generation (F1). Results showed that the body weights of P and F1were decreased (P<0.05), and pregnancy rate, litter size, live birth index and viability index on day 4 in high AEE dose group were also lower than those of control group. In addition, high male proportion in sex ratio of F1was very abnormal. Pregnant rats and weaning index in aspirin group grew slowly (P<0.05). Compared to control group,testis and epididymis indexes of P rats in high dose AEE group were high (P<0.05), and epididymis indexes of F1rats in aspirin and eugenol groups were also high (P<0.05). Under the experimental condition, AEE had reproductive toxicity in rats. No observed adverse effect level was 31.1 mg·kg-1·d-1. Low observed adverse effect leve was 124.5 mg·kg-1·d-1.

aspirin eugenol ester；reproductive toxicity；developmental toxicity；reproductive indexes

2016-09-25

A

1002-1280 (2017) 02-0054-05

S859.81

國家自然基金項目(31572573)

趙曉樂，碩士研究生，從事藥物繁殖毒性研究。

李劍勇。E-mail： lijy1971@163.com