高效液相色譜-熒光法測定牛羊組織中阿苯達唑及其代謝物的殘留量

吳寧鵬，彭麗，孟蕾，陳彥龍，馬浩軒(．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008； ．鄭州大學，鄭州 450000； ．河南省鄭州市第七高級中學，鄭州 450008)

高效液相色譜-熒光法測定牛羊組織中阿苯達唑及其代謝物的殘留量

吳寧鵬1，彭麗1，孟蕾1，陳彥龍2，馬浩軒3
(1．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008； 2．鄭州大學，鄭州 450000； 3．河南省鄭州市第七高級中學，鄭州 450008)

建立了同時測定牛羊組織中阿苯達唑及其代謝物的高效液相色譜-熒光檢測方法。試樣中待測物經(jīng)乙酸乙酯提取，酸性氧化鋁固相萃取柱和MCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-熒光法測定，以外標法定量。藥物在5～2000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999。方法的檢出限為0.025 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg，在不同組織中添加濃度范圍為0.05～10 mg/kg，其平均回收率為60.6%～119.1%，相對標準偏差在1.7%～19.1%之間。方法抗干擾能力強、靈敏度高，適用于牛羊組織中阿苯達唑及其代謝物殘留量的測定。

牛羊組織；阿苯達唑及其代謝物；高效液相色譜-熒光法

阿苯達唑(ABZ)是一種苯并咪唑類驅蟲藥物，是抗蟲性最強的驅蟲藥物之一。廣泛用于動物的腸道寄生蟲感染病，在我國獸醫(yī)臨床使用最廣泛[1]。阿苯達唑在動物體內(nèi)不穩(wěn)定，動物口服攝入后，經(jīng)腸道消化后會在較短時間內(nèi)代謝為阿苯達唑亞砜(ABZSO)、阿苯達唑砜(ABZSO2)、阿苯達唑-2-氨基砜(ABZ-2NH2-SO2)[2]。動物毒理學表明阿苯達唑及其活性代謝物阿苯達唑亞砜具有致畸及胚胎毒性作用[3]。

由于一些養(yǎng)殖戶為追求經(jīng)濟利益，違規(guī)使用而且長期、超量使用，從而使阿苯達唑及其代謝藥物在動物組織中殘留，因此，世界食品法典委員會和世界各國對動物源性食品中阿苯達唑藥物殘留均有嚴格的限量要求，國際貿(mào)易中也對其限量有嚴格規(guī)定[4]。我國規(guī)定在牛、豬、羊、雞等動物的肌肉、脂肪、肝、腎等食品中阿苯達唑及其代謝藥物最高殘留限為0.05～1.0 mg/kg[5]。國內(nèi)外對阿苯達唑及其代謝物檢測分析方法報道較多，主要包括免疫檢測法(ELISA)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[2,7-10]、液相色譜串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[11-12]和氣相質譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)[13]等。其中，HPLC-FLD法因具有檢測成本低、靈敏度高等優(yōu)點，被廣泛應用于阿苯達唑及其代謝物的檢測。目前牛羊組織中阿苯達唑及其代謝藥物殘留的檢測方法中，存在空白干擾嚴重、靈敏度低、適應性差等問題，因此，本文對牛羊組織中阿苯達唑及其代謝物藥物殘留的樣品前處理法進行了改進，減小基質干擾，從而提高檢測的準確度，從源頭上保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀配熒光檢測器(Waters公司)；XP205分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation)；SIGMA 3-30K離心機(德國SIGMA公司)； MS3 basic渦旋混合器(IKA)。阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜，含量均大于98.3%，購于Dr. Ehrenstorfer公司，阿苯達唑氨基砜對照品，購于德國WITEGA；Waters Oasis MCX 固相萃取柱(6mL/150 mg)；Supelco酸性氧化鋁固相萃取柱(3 mL/1 g)。甲醇、乙腈、乙酸銨(色譜純)；二甲基亞砜(DMSO)、碳酸鈉、焦亞硫酸鈉、乙酸乙酯、正己烷、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、冰醋酸(分析純)；實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水。

0.5 mol/L乙酸銨溶液：取1.927 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至500 mL，用冰醋酸調節(jié)pH至5.0。

1.2 標準溶液的配制 準確稱取阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑氨基砜標準品各10 mg，分別于100 mL容量瓶中，用乙腈:二甲基亞砜(9:1)溶解并定容，配制成濃度為0.1 mg/mL的阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑氨基砜標準貯備液，-20 ℃以下保存，有效期1個月。

1.3 樣品前處理 稱取試樣(2±0.02)g于50 mL離心管中，加2%的碳酸鈉溶液0.5 mL， DMSO 1 mL和0.004 g/mL焦亞硫酸鈉溶液溶液1 mL，渦旋1 min，加入乙酸乙酯10 mL，渦旋1 min，振蕩5 min， 10000 r/min離心5 min，取上清液。殘渣再加入乙酸乙酯10 mL，渦旋1 min，振蕩5 min， 10000 r/min離心5 min，取上清液。合并兩次上清液，40 ℃氮吹至近干，用正己烷5 mL復溶，加入乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)2 mL溶液，渦旋1 min，靜置分層，棄去上層正己烷，余液作為備用液1。

酸性Al2O3固相萃取柱依次用乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)溶液3 mL、1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液3 mL活化，取備用液1過柱，收集流出液，用乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)1 mL溶液淋洗，合并流出液，加0.2 mol/L鹽酸溶液8 mL，混勻作為備用液2。MCX柱依次用甲醇3 mL、1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液3 mL、水3 mL、0.2 mol/L鹽酸溶液3 mL活化，取備用液2過柱，待全部液體流出后，依次用0.2 mol/L鹽酸溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，抽干1 min，10%氨化乙腈溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴氮氣吹干。用乙腈∶甲醇∶0.5 mol/L乙酸銨溶液(V∶V∶V/2∶2∶8)1 mL溶解殘余物，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜測定(上機溶液應在72 h內(nèi)完成測定)。

1.4 液相色譜參考條件 色譜柱：Waters Xbridge C18 (4.6×150 mm, 5 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相A為乙腈，B為甲醇,C為0.5 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序見表1。激發(fā)波長290 nm,發(fā)射波長330 nm。

表1 流動相梯度洗脫條件

2 結果與分析

2.1 線性范圍 準確移取阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑氨基砜標準溶液液適量，用乙腈∶甲醇∶0.5 mol/L乙酸銨(V∶V∶V/2∶2∶8)溶液稀釋，配置成一系列濃度的混合標準溶液，從低濃度到高濃度依次進樣，以色譜峰平均峰面積為縱坐標，對應濃度為橫坐標，繪制標準曲線，各藥物的回歸方程及相關系數(shù)見表2。

表2 藥物回歸方程及相關系數(shù)

2.2 方法的靈敏度 添加適量混合標準溶液于2 g空白樣品中，經(jīng)提取后測定，依據(jù)信噪比S/N>3(按PtP算)，確定阿苯達唑及其代謝藥物的檢出限均為0.025 mg/kg。依據(jù)信噪比S/N>10(按PtP算)，確定阿苯達唑及其代謝藥物的定量限均為0.05 mg/kg。2.3 方法的準確度和精密度考察 本方法考察了在牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中的添加回收情況。采用標準加入法，在空白樣品中添加0.05、2.5、5、10 mg/kg 4個不同濃度的阿苯達唑及其代謝物標準品，進行準確度和精密度試驗，各濃度進行5個樣品平行試驗，重復3次，求相對標準偏差，計算結果見表3。

表3 牛、羊組織中阿苯達唑及代謝物回收率和相對標準偏差

從表中可以看出，本方法在空白牛羊組織中進行0.05～10 mg/kg的添加，平均回收率在60.6%～119.1%之間，批間相對標準偏差在1.7%～19.1%之間。說明該方法有較好的準確度與精密度。阿苯達唑及其代謝物標準溶液、空白及添加色譜圖分別見圖1～圖3。

3 討論與小結

3.1 儀器條件 阿苯達唑及其代謝物屬于苯并咪唑類物質，既有紫外吸收又有熒光吸收。因此，按照參考文獻方法分別選用紫外檢測器和熒光檢測器作為阿苯達唑及其代謝物的檢測，實驗結果表明選用熒光檢測器對動物組織樣品測定時，雜質干擾小，準確度高。因此，選擇熒光檢測器作為動物組織中阿苯達唑及其代謝物的檢測器。

阿苯達唑類藥物殘留檢測常用的流動相體系有甲酸-乙腈和乙酸銨-乙腈-甲醇等流動相體系，試驗過程中對兩種流動性體系進行了比較，最終確定了用0.05 mol/L乙酸銨-乙腈-甲醇(80∶10∶10)作為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，能夠很好的控制阿苯達唑氨基砜、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜和阿苯達唑的保留時間，避免了出峰較早易受到雜質峰干擾，也克服了保留時間較長而導致色譜峰展寬。

圖1 阿苯達唑及其代謝物標準溶液色譜圖(100 μg/L)

圖2 羊肝組織空白試樣色譜圖

圖3 羊肝組織空白添加阿苯達唑及其代謝物色譜圖(0.05 mg/kg)

3.2 提取條件 本方法參考了相關文獻和檢測方法，提取液分別用乙腈、乙酸乙酯和乙腈+乙酸乙酯(V∶V/3∶1)為提溶劑進行5次平行提取實驗。由實驗結果可知，對于四種藥物的提取效率為乙酸乙酯>乙腈+乙酸乙酯>乙腈，同時用乙酸乙酯作為提取溶劑時雜質干擾明顯低于乙腈。因此，選用乙酸乙酯為動物組織中阿苯達唑及其代謝物的提取溶劑。由于阿苯達唑及其代謝物具有弱堿性，在不同的鹽溶液和pH 條件下電離度不同，所以參考了國內(nèi)外一些文獻在乙酸乙酯提取溶液中加入5% NaOH、10% Na2SO4和2%Na2CO3，實驗結果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取溶劑中加入0.5 mL 2%Na2CO3使提取液呈弱堿性，在該條件下阿苯達唑及其三種代謝物均有較高的回收率。為了減小基質對阿苯達唑及其代謝藥物檢測的干擾，在提取時加入1 mL抗氧化劑Na2S2O5(4 mg/mL)。

3.3 凈化方法 參照文獻的凈化方法，先后比較了Sep-Pak C18(6 mL 150 mg)、Oasis MCX(6 mL 150 mg)、Oasis HLB(6 mL 150 mg)、ProElut SCX(6 mL 150 mg)固相萃取柱，結果表明MCX回收率最高。但由于樣品基質比較復雜，僅過MCX柱凈化，雜質干擾嚴重，尤其組織樣品中極性化合物和陰離子化合物會影響動物組織中痕量的阿苯達唑及其代謝物的檢出。因此，最終選用酸性Al2O3和MCX固相萃取柱作為凈化柱。

該方法具有較好的靈敏度、準確度和精密度，適用于牛羊組織中阿苯達唑及其代謝物殘留量的測定。

[1] 周麗萍. 動物組織中阿苯達陛代謝物多殘留檢測方法的研究[D]. 濟南：山東大學，2009.

[2] 張小軍, 鄭斌, 張虹, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定草魚肉中阿苯達唑及其代謝物殘留[J]. 分析化學，2011，39：815-820.

[3] Botsoglou N A,Fletouris D J. Drug residues in foods,pharmacology,food safety and analysis[M].New York:Marcei,Dekker Inc.,2001:269-298.

[4] Couneil Regulation No. 2377/90 and Commission Regulation Nos. 508/1999, 2385/1999, 2393/1999 and 807/2001[S].

[5] 李俊鎖, 邱月明, 王超.獸藥殘留分析[M]. 上海：上?？茖W技術社, 2002: 459-495.

[6] 伏旭,李培武, 賀莉,等.酶聯(lián)免疫吸附檢測法的應用研究進展[J]. 氨基酸和生物資源, 2012, 34: 41-44.

[7] Dowling G, Cantwell H, O’Keeffe M,etal. Multi-residue method for the determination of benzimidazoles in bovine liver[J]. Anal Chim Acta, 2005, 529: 285-292.

[8] Moreno L, Lopez-Urbina M T, Farias C,etal. A high oxfendazole dose to control porcine cysticercosis: Pharmacokinetics and tissue residue profiles[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50: 3189-3825.

[9] Lange H, Eggers, Bircher J. Increased Systemic Availability of Albendazole when Taken with a Fatty Meal[J]. Eur J Clin Pharmacol, 1988,34:315-317.

[10]張素霞, 沈建忠,丁雙陽，等. 牛肝中苯并咪唑類藥物殘留的高效液相色譜檢測方法[J]. 中國獸藥雜志, 2005, 39: 18-21.

[11]郭強,常孝勇. 動物組織中苯并咪唑類藥物檢測的LC-MS/MS法研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2012,41:152-156.

[12]Balizs G. Determination of benzimidazole residues using liquid Chromatography and tandem mass speetrometry[J]. J Chromatogr B,1999,727:167-177.

[13]Markus J, Sherma J. Gas-chromarographic-mass spectrometric confirmatory Method for albendazole residues in cattle liver[J].J AOAC Int,1992,75:1135-1137.

(編輯：侯向輝)

Determination of Albendazole and Its Main Metabolites Residues in Cattle and Ovine Tissues by HPLC-FLD

WU Ning-peng1，PENG Li1，MENG Lei1，CHEN Yan-long2，MA Hao-xuan3(1.HenanInstituteofVeterinaryDrugandFeedsControl,Zhengzhou450008，China;2．ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000，China;3．HenanProvinceZhengzhouNo.7MiddleSchool,Zhengzhou450008，China)

A method based on high performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD) has been developed for the determination of albendazole and its main metabolites residues in cattle and ovine tissues. The analytes were extracted with ethyl acetate, and cleaned by Alumina-A and MCX solid phase extraction cartridges. Quantification of the analytes were achieved by HPLC-FLD using external standard method. The calibration curves of the drugs were linear in the concentration ranges of 5～2000 μg/L with correlation coefficients more than 0.999. Detection limits and quantification limits of the method for the analytes were 0.025 mg/kg and 0.05 mg/kg in cattle and ovine tissues. The average recoveries ranged from 60.6% to 119.1% at the spiked level of 0.05～10 mg/kg in tissues. The relative standard deviation was in the range of 1.7%～19.1%. With the advantages of good anti-interference ability and sensitivity, the method adapts to the determination of albendazole and its main metabolites residues in cattle and ovine tissues.

cattle and ovine tissues; albendazole and its main metabolites；HPLC-FLD

2016-10-10

A

1002-1280 (2017) 02-0035-05

S859.84

2016年國家畜禽產(chǎn)品未知危害因子識別與已知危害因子安全性評估項目(GJFP2016007)

吳寧鵬，高級獸醫(yī)師，從事獸藥質量監(jiān)測與監(jiān)督研究。E-mail:wnppeking2002@163.com