QuEChERS-超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)豬組織中賽庚啶及可樂定殘留量

李丹妮，嚴(yán)鳳，周悅榕，沈偉強(qiáng)，陶軍，張婧(.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 00；.上海市松江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 060；.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 0800)

QuEChERS-超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)豬組織中賽庚啶及可樂定殘留量

李丹妮1，嚴(yán)鳳1，周悅榕1，沈偉強(qiáng)2，陶軍3，張婧1
(1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；2.上海市松江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201620；3.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201800)

建立了QuEChERS前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)豬組織中賽庚啶和可樂定殘留量的方法。豬肉樣品添加0.5 g C18粉，豬肝和豬腎樣品添加3.0 g硫酸鎂和2.0 g氯化鈉，再分別加入10 mL 0.1%甲酸乙腈進(jìn)行提取，提取液經(jīng)濃縮后采用LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。該方法線性關(guān)系良好，豬肉、豬肝和豬腎中賽庚啶和可樂定在1～50 μg/kg濃度范圍內(nèi)加標(biāo)回收率分別為62%～112%和106%～121%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，方法檢出限為0.5 μg/kg。方法靈敏度高，選擇性好，可作為豬組織中賽庚啶和可樂定殘留量檢測(cè)的確證方法。

賽庚啶；可樂定；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；豬組織

賽庚啶(Cyproheptadine, CYP)，是一種組胺H1受體拮抗藥[1]，作為人用藥可用于蕁麻疹、濕疹、過敏性和接觸性皮炎等疾病。賽庚啶可以通過結(jié)合下丘腦的5-羥色胺位點(diǎn)阻斷其活性[2]，興奮攝食中樞，從而達(dá)到增加動(dòng)物體重和促進(jìn)采食的作用。可樂定(Clonidine，CLO)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腎上腺素能α2-受體激動(dòng)劑[3]，屬于咪唑啉衍生物，近年來開始將可樂定用于促進(jìn)動(dòng)物生長和改善酮體組成的研究[4]。因此，出現(xiàn)了將可樂定和賽庚啶兩種藥物在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中進(jìn)行非法使用的情況，消費(fèi)者在食用含有藥物殘留的生豬產(chǎn)品后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的食品安全隱患。賽庚啶和可樂定作為新型非法添加物已被寫入農(nóng)業(yè)部1519號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》，明確禁止使用。目前已有開展關(guān)于飼料[5]、豬尿[6]、動(dòng)物飲水[7]、血液[8]、食品[9]及動(dòng)物組織[10-11]基質(zhì)中可樂定及賽庚啶含量的相關(guān)檢測(cè)方法，研究組織中的賽庚啶和可樂定殘留量檢測(cè)有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(Waters?UPLC-TQ MS，Masslynx?工作軟件)；PL202-L感量為0.01 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；AB135-S感量為0.00001 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；漩渦混合器(美國 Talboys公司)； TARGIN VX-Ш多管渦旋振蕩器(北京踏棉科技有限公司)。AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN COULTER公司)； N-EVAP112 氮吹儀(美國 Orangaomation公司)；Milli-Q A10 超純水機(jī)(美國Millipore)； 0.22 μm 親水PTFE過濾膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。Sk7210HP 超聲波清洗器(上海科導(dǎo)公司)；C18粉(美國Agilent公司)；乙腈、甲酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；無水硫酸鎂、無水氯化鈉(化學(xué)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品： 鹽酸賽庚啶(純度98%)，鹽酸可樂定(純度98%)，鹽酸二苯拉林(純度98%)，以上均購自美國sigma公司。鹽酸可樂定-D4(純度98%)，來源CDN，含量大于98%。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精密稱取鹽酸賽庚啶(以賽庚啶計(jì))、鹽酸可樂定(以可樂定計(jì))、鹽酸二苯拉林(以二苯拉林計(jì))和鹽酸可樂定-D4(以可樂定-D4計(jì))對(duì)照品各10.0 mg，分別于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度均為1 mg/mL的鹽酸賽庚啶、鹽酸可樂定、鹽酸二苯拉林和鹽酸可樂定-D4標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合內(nèi)標(biāo)工作液的配制：分別精密量取鹽酸賽庚啶和鹽酸可樂定貯備液各1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為10 μg/mL的鹽酸賽庚啶和鹽酸可樂定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密量取1 mg/mL鹽酸二苯拉林貯備液100 μL和1 mg/mL鹽酸可樂定-D4貯備液1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成鹽酸二苯拉林的濃度為1 μg/mL和鹽酸可樂定-D4的濃度為10 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制：精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合內(nèi)標(biāo)工作液適量，用乙腈-0.1%甲酸溶液稀釋成賽庚啶和可樂定濃度為0.5、1、10、50、100 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中含鹽酸二苯拉林的濃度和鹽酸可樂定-D4的濃度分別為5 μg/L和50 μg/L，臨用現(xiàn)配。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent C18(100 mm×2.1 mm，粒徑1.8 μm)，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相 A為乙腈；B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～4 min，20～60% A；4～4.5 min，60～95% A；4.5～6.5 min，95% A；6.5～8.0 min，95～20% A；8.0～10 min，20% A。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電離模式：正離子電噴霧電離(ESI+)；質(zhì)譜檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；脫溶劑溫度：500 ℃；孔流速：50 L/h；碰撞氣(Ar)流速：0.3 mL/min。分析中以保留時(shí)間和離子對(duì)豐度比作為定性分析依據(jù)，經(jīng)過試驗(yàn)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 可樂定、賽庚啶及其內(nèi)標(biāo)化合物的MRM參數(shù)

在定量離子的選擇過程中，避免選擇干擾較大的100以內(nèi)的離子通道。

1.2.3 樣品前處理 稱取試料(2.00±0.02)g于50 mL離心管中，加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液后，豬肉樣品加入0.5 g C18粉，豬肝和豬腎樣品加入3.0 g硫酸鎂和2.0 g氯化鈉，振蕩混勻，加0.1%甲酸乙腈10 mL，充分振蕩，于8000 r/min離心5 min，取上清液，于離心管中，于50 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑?.0 mL 0.1%甲酸/乙腈(80/20)溶液溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 可樂定和賽庚啶的混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照工作液用流動(dòng)相配制，線形范圍為0.5～100 ng/mL。用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定工作液，獲得內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線A賽庚啶=0.9721+0.1346C，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9959，A可樂定=0.7702C+0.1782，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9928。

2.2 方法回收率與精密度 選擇空白豬肝、豬肉、豬腎樣品作為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，在豬組織中添加可樂定和賽庚啶濃度為1、2、10、50 μg/kg的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確性和精密度。每批次內(nèi)同一濃度做6次平行實(shí)驗(yàn)，共重復(fù)3批次，結(jié)果見表2～表4，豬肉中添加回收?qǐng)D譜見圖1。豬組織中可樂定回收率達(dá)到106%～121%，賽庚啶回收率達(dá)到62%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%。

表2 豬肉中添加可樂定和賽庚啶回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 豬肝中添加可樂定和賽庚啶回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 豬腎中添加可樂定和賽庚啶回收率試驗(yàn)結(jié)果

圖1 豬肉中可樂定和賽庚啶添加回收率MRM圖(添加濃度10 μg/kg)

2.3 檢測(cè)限和定量限 豬腎、豬肝、豬肉樣品中可樂定和賽庚啶方法最低檢測(cè)限為0.5 μg/kg，信噪比S/N(Peak to Peak)>3。方法最低定量限為1.0 μg/kg，信噪比S/N(Peak to Peak)>10。

3 討論與小結(jié)

3.1 定量方法的確定 藥物分析一般均采用外標(biāo)法，體內(nèi)藥物分析因提取步驟煩瑣，其回收率會(huì)受到較大影響，故盡量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。本研究選擇可樂定-D4可作為可樂定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。二苯拉林(Diphenylpyraline, DPP)的分子結(jié)構(gòu)式和理化性質(zhì)與賽庚啶相似(圖2～圖3)，且二苯拉林并不存在于自然環(huán)境中，因此在目前尚未合成賽庚啶同位素化合物的情況下可以作為檢測(cè)賽庚啶的良好的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[12]。

圖2 賽庚啶和二苯拉林分子結(jié)構(gòu)式

圖3 可樂定和可樂定-D4分子結(jié)構(gòu)式

3.2 基質(zhì)效應(yīng)的考察 本研究通過基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索二苯拉林作為賽庚啶內(nèi)標(biāo)的適宜性。將豬肉、豬肝、豬腎空白樣品按1.2.3項(xiàng)所述前處

理步驟進(jìn)行前處理，得到相應(yīng)的空白基質(zhì)溶液，用此基質(zhì)溶液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，配置為含鹽酸二苯拉林的濃度和鹽酸可樂定-D4的濃度分別為5 ng/mL和50 ng/mL，可樂定和賽庚啶濃度范圍為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣后得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)如表5，可知選擇鹽酸二苯拉林和鹽酸可樂定-D4作為賽庚啶和可樂定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，基質(zhì)效應(yīng)影響效果趨勢(shì)一致，因此可以充分達(dá)到校正基質(zhì)效應(yīng)校準(zhǔn)結(jié)果的目的。

表5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)

3.3 QuEChERS方法的優(yōu)化 QuEChERS技術(shù)因高通量、快速、成本低的特點(diǎn)，近年由農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域逐步被引入到獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，并發(fā)表了大量的相關(guān)研究文章[13-15]。本研究在比較固相萃取與QuEChERS方法后，選擇了QuEChERS方法作為前處理方法開發(fā)的主要方向，基于市售QuEChERS方法對(duì)除水劑、凈化吸附劑進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)豬肉、豬肝、豬腎樣品不同的含水量及基質(zhì)特點(diǎn)，在含水量較高的豬腎和豬肝樣品前處理中選擇了無水硫酸鎂和氯化鈉作為除水劑，分別比較了不同量的無水硫酸鎂和氯化鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(表6～表7)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)無水硫酸鎂為3.0 g、氯化鈉為2.0 g時(shí)，除水效果和回收率情況最理想。在含水量較少的豬肉前處理過程中僅選擇了C18粉作為吸附劑，C18可有效去除脂類、糖類等親脂型雜質(zhì)，但過量的C18吸附劑也會(huì)吸附目標(biāo)化合物而使回收率降低，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，0.5 g C18已經(jīng)能滿足檢測(cè)靈敏度、凈化效果和回收率的要求，同時(shí)可達(dá)到簡化前處理步驟的效果。

表6 無水硫酸鎂加入量對(duì)回收率的影響

表7 氯化鈉加入量對(duì)回收率的影響

本方法應(yīng)用優(yōu)化的QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了豬肉、豬肝和豬腎中可樂定和賽庚啶的殘留檢測(cè)方法。與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，采用QuEChERS凈化技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)更好的基質(zhì)凈化效果，操作簡便，提升了檢測(cè)效率。該方法對(duì)豬肉、豬肝和豬腎中賽庚啶和可樂定在1～50 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率分別為62%～112%和106%～121%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，方法檢出限達(dá)到0.5 μg/kg，能夠滿足對(duì)豬可食組織豬肉、豬肝、豬腎中可樂定和賽庚啶殘留量的測(cè)定。

[1] 張慶柱,耿金榮. 賽庚啶的藥理與臨床研究進(jìn)展[J]. 中級(jí)醫(yī)刊,1996,3:47-49.

[2] 張加力,岳云光. 賽庚啶治療食欲不振70例[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,1994,3:29-30.

[3] 余濤,何玲. α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 臨床合理用藥雜志,2012,14:166-167.

[4] 王雷杰,占秀安,許梓榮,等.可樂定對(duì)生長豬胴體組成的影響及其作用機(jī)理探討[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2005,5:654-658.

[5] 曹瑩,蔣音,張文剛. 高效液相色譜法分析飼料中的賽庚啶[J]. 中國飼料,2011,2:39-40.

[6] 曲斌,陸桂萍,蔣天梅,等.固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定豬尿中的賽庚啶[J]. 中國獸藥雜志,2013,1:28-31.

[7] 楊建文,劉雅紅,王宗楠,等.賽庚啶-分子印跡聚合物的制備及其固相萃取研究[J]. 分析化學(xué),2014,6:878-884.

[8] 孫成文,王漢斌,李嘉琳,等.中毒患者血液中可樂定液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法的研究[J]. 毒理學(xué)雜志,2014,5:360-363.

[9] 孟娟,張晶,邵兵. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定食品中的可樂定[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2013,3:655-659.

[10]萬宇平,羅曉琴,郝小妹,等.動(dòng)物組織中賽庚啶競爭酶聯(lián)免疫法的建立[J]. 中國釀造,2014,10:130-132.

[11]陳其煌. 高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肝中可樂定和賽庚啶[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,3:623-629.

[12]吳劍平，張鑫，顧欣，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬尿中鹽酸賽庚啶殘留量-內(nèi)標(biāo)法[J]. 中國飼料,2013,6:15-18.

[13]卜明楠,石志紅,康 健,等. QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定蝦肉中72種獸藥殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào),2012,5:552-558.

[14]馮楠,路勇,姜潔,等. QuEChERs-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查食品中73種有毒有害物質(zhì)[J]. 食品科學(xué),2013,16:214-220.

[15]郭海霞,肖桂英,張禧慶,等. QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)豬肉中121種獸藥[J]. 色譜,2015,12:1242-1250.

(編輯：侯向輝)

Simulaneous Determination of Cyproheptadine and Clonidine in Pig Issues by QuEChERS and Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LI Dan-ni1, YAN Feng1, ZHOU Yue-rong1, SHEN Wei-qiang2, TAO Jun3, ZHANG Jing1(1.ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China；2．ShanghaiSongjiangAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201620,China；3.ShanghaiJiadingAgriculturalTechnologyExtensionServiceCenter，Shanghai201800,China)

A method has been developed for the simultaneous determination of the cyproheptadine and clonidine residuals in pig issues using QuEChERS method coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The drugs were extracted with sufficiently acidic acetonitrile. Anhydrous magnesium sulfate and anhydrous sodium chloride were used for the salting-out process. C18 powder was used for the clean-up process. The drugs were analyzed by UPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode via electrospray ionization. Cyproheptadine and clonidine were quantified by internal standard method. The calibration curves of the drugs were linear in the range of 0.5～100 ng/mL with the correlation coefficients more than 0.99. The LOD of cyproheptadine and clonidine in pig issues were 0.5 μg/kg. Add in the blank pig issues 1～50 μg/kg level, an average recovery of 62%～112% for cyproheptadine, and 106%～121% for clonidine with the relative standard deviation was <10%. The method is simple, rapid and high recovery and good reproducibility for quantitative and confirmatory analysis in cyproheptadine and clonidine residues.

cyproheptadine; clonidine; LC/MS/MS; pig issues

2016-08-26

A

1002-1280 (2017) 02-0029-06

S859.84

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 [滬農(nóng)科攻字(2014)第3-3號(hào)]；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203023)

李丹妮，高級(jí)畜牧師，從事獸藥殘留檢測(cè)與方法開發(fā)。E-mail: yure@yeah.net