禽源多殺性巴氏桿菌多位點序列分型研究

李偉杰，田野，豈曉鑫，蔣穎，魏財文，蔣桃珍(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

禽源多殺性巴氏桿菌多位點序列分型研究

李偉杰，田野，豈曉鑫，蔣穎，魏財文，蔣桃珍*
(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

為了解國內禽源多殺性巴氏桿菌流行情況，對分離自18省份的84株多殺性巴氏桿菌采用莢膜多重PCR分型和多位點序列分型對其血清型和基因型進行鑒定。結果表明：禽源多殺性巴氏桿菌主要以血清A型為主，占96.4%(81/84)；多位點序列分型可將禽源多殺性巴氏桿菌分為 5種ST型，其中ST129為主要流行型，占94.0%(79/84)。本研究為我國禽源多殺性巴氏桿菌的流行病學監測和基因多樣性提供了數據支持。

多殺性巴氏桿菌；莢膜分型；多位點序列分型

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起的雞、鴨和鵝等多種禽類的一種接觸性、敗血性傳染病[1]。病禽、康復禽或健康帶菌禽是主要的傳染源，主要通過被污染的飼料、飲水經消化道感染，多發生于性成熟的禽類，自然感染潛伏期為2～9 d。在潮濕、多雨、氣溫較高的季節時有發生。本病是危害我國養禽業的重要細菌性傳染病之一。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)[2]、腸道細菌基因間重復序列(ERIC-PCR)指紋圖譜技術[3]和多位點序列分型(MLST)[4]等方法推動了對多殺性巴氏桿菌分子流行病學和基因多樣性的研究。現在MLST已經成為病原菌基因分型的金標準，在分子流行病學調查中得到廣泛應用[5-7]。由于國內對禽源多殺性巴氏桿菌的基因多樣性和分子流行病學狀況研究的不多，因此本研究擬對分離和收集的禽源多殺性巴氏桿菌進行MLST分型，以便為我國多殺性巴氏桿菌病暴發的流行病學監測和基因多樣性研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 菌株 84株分離株分離自國內的不同地區和不同年代(表1)，由中國獸醫微生物菌種保藏管理中心提供。

表1 多殺性巴氏桿菌的血清分型和MLST分型

續表

續表

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購自OXOID公司，馬血清購自GIBCO公司，Ex Taq酶、DL2000 DNA Maker購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購自Biowest公司，Goldview購自北京賽百盛基因技術有限公司。

1.3 菌株DNA的提取 分離株在含5%馬血清的TSA培養基上，37 ℃培養24 h采用熱裂解法[8]提取基因組 DNA，挑取純培養菌落于100 μL無菌蒸餾水中，沸水浴10 min，然后冰浴10 min，12000 r/min離心1 min，上清作為PCR擴增的模板DNA。

1.4 菌株kmtI基因的擴增及序列分析 按照文獻方法[9]對分離株進行kmtI基因的PCR擴增，擴增產物測序后與 NCBI 核酸數據庫進行 BLAST序列比對。

1.5 菌株血清型的鑒定 按照Townsend等[9]建立的多殺性巴氏桿菌莢膜多重PCR方法對分離株血清型進行鑒定，引物見表2，PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表2 多殺性巴氏桿菌種鑒定、莢膜血清分型和MLST的引物

*在zwf-1對應的引物不能有效擴增的情況下使用

1.6 MLST 分型 根據Subaaharan等[4]建立的禽源多殺性巴氏桿菌 MLST 分型方法，對本研究中84株分離株的7個看家基因(腺苷酸環化酶基因adk、酯酶基因est、6-磷酸-甘露糖異構酶基因pmi、葡萄糖-6磷酸脫氫酶基因zwf、蘋果酸脫氫酶基因mdh、谷氨酸脫氫酶基因gdh、磷酸葡萄糖異構酶基因pgi)進行擴增及測序，引物見表2。序列經MEGA7軟件編輯后，提交到RIRDC MLST在線數據庫進行比對，獲得菌株的序列型，并利用 MEGA7軟件對RIRDC MLST 數據庫中的部分 ST 型進行序列比對，構建系統發育樹，分析其分子進化關系。

2 結果與分析

2.1 分離株的kmtI鑒定 通過對 84株分離株進行kmtI基因的擴增和測序，提交 GenBank進行 BLAST 比對，結果顯示與多殺性巴氏桿菌的相似性均達 99 %以上。表明本研究中收集和分離的84株分離株均為多殺性巴氏桿菌。

2.2 血清分型 利用莢膜多重PCR 方法將 84株多殺性巴氏桿菌分為 A和B共2種血清型，其中81株為A型，占96.4%；其余3株為B型，且均分離自霍亂雞(表1)。

2.3 MLST分型 對84株多殺性巴氏桿菌分別進行adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh和pgi7個看家基因的擴增和測序，結果顯示可以將其分為 ST129、ST122、ST107、ST62和ST44 5種 ST 型，其中禽源多殺性巴氏桿菌主要以 ST129 型為主，占94%(79/84)具體見表1。利用 MEGA7對本研究確定的5個ST型和國內報道的其他ST型[10]進行序列分析，結果表明：國內分離株ST122和ST44親緣關系最近，ST62和ST58親緣關系最近；主要流行的ST-129型與ST122、ST44、ST62、ST58具有較近的親緣關系，在同一大的分支上；ST8和ST107與其他的ST型親緣關系較遠(圖1)。

圖1 84株禽源多殺性巴氏桿菌的多位點序列系統進化樹

3 討論與小結

多殺性巴氏桿菌根據莢膜抗原可分為A、B、D、E和F 5種血清型，本研究通過莢膜多重PCR方法對84株禽源多殺性巴氏桿菌(主要分離收集自1953年至1990年)進行血清分型，結果有81株為莢膜A型。程安春等[11]對從1990-1995年分離自四川省不同地區的256株鴨源多殺性巴氏桿菌進行血清分型，其中254株為莢膜A型，2株未定型；程龍飛等[12]收集2007-2013年福建及鄰近省份分離的95株禽源多殺性巴氏桿菌，經鑒定莢膜型全為A型；Wang等[5]對2011-2012年分離自江蘇省不同地區的40株禽源多殺性巴氏桿菌流調結果顯示全部為莢膜A型。以上研究都表明多年來國內引起禽霍亂的優勢血清型為A型。

多殺性巴氏桿菌的MLST是由多位點酶電泳(MLEE)衍生出來，主要通過看家基因序列的多態性對細菌進行分類[4]。由MLST得到的分型結果可與數據庫中已有的信息進行比對，從而使不同地點和不同時間分離的菌株可以進行橫向和縱向比較。目前多殺性巴氏桿菌多位點序列分型的在線數據庫有兩個(http://pubmlst.org/pmultocida/)：Multiple host MLST由英國格拉斯哥大學開發，針對不同宿主來源的多殺性巴氏桿菌；RIRDC MLST由澳大利亞動物研究所開發，針對禽源多殺性巴氏桿菌。截止2016年11月18日，RIRDC MLST數據庫中已經鑒定有329種 ST 型。本研究通過對84株多殺性巴氏桿菌MLST的鑒定，獲得5個ST型，主要以 ST129為主，占94%(79/84)，與文獻報道[5,10]的一致。還鑒定到 ST122、ST107、ST62和ST44，這在禽源多殺性巴氏桿菌中為國內首次報道。由于MLST能夠區分親緣關系較近的菌株，能夠對爆發的流行菌株進行溯源，因此本研究中基因型相同的79株菌株可能來源于同一株多殺性巴氏桿菌?？紤]到ST129型已在斯里蘭卡[6]、印度[7]和丹麥等(http://pubmlst.org/pmultocida/)許多國家被發現，此基因型可能在全球都有分布。同時它可以從發生禽霍亂的雞、鴨、鵝和麻雀體內分離到，說明它具有多動物宿主的特性。

綜上所述，本研究為禽源多殺性巴氏桿菌的流行病學提供了一些本底數據，為今后多殺性巴氏桿菌的監測起到了支撐作用，同時對于研制有效的疫苗預防和控制禽霍亂有一定的幫助。

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(編輯：李文平)

Multi-locus Sequence Typing ofPasteurellamultocidaIsolated from Avian

LI Wei-jie，TIAN Ye，QI Xiao-xin，JIANG Ying，WEI Cai-wen，JIANG Tao-zhen*
(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Bejing100081,China)

To investigate the epidemic status of thePasteurellamultocidaisolated from avian, eighty-fourP.multocidaisolates collected from 18 provinces were subject to identifications of the serotypes and genotypes by capsular multiplex PCR and multi-locus sequence typing. The results showed thatP.multocidaisolated from avian were mainly classified into serotype A, accounting for 94.6%. Five different sequence types including ST129, ST122, ST107, ST62, ST44 were identified by MLST, and the predominate genotype was ST129, accounting for 94.6%. The present study provides data support for the epidemiological surveillance and genetic diversity ofP.multocidaisolated from avian.

Pasteurellamultocida; capsular serotyping; multi-locus sequence typing

2016-11-21

A

1002-1280 (2017) 02-0001-06

S852.61

生物安全關鍵技術研發(2016YFC1201603)；國家微生物資源平臺(NIMR-5)

李偉杰，副研究員，從事獸醫微生物和獸用生物制品研究。

蔣桃珍。E-mail：jiangaozhen@ivdc.org.cn