凡納濱對蝦血細胞數量變化與抗弧菌感染關系研究

袁嘯天+宋彥璋+劉喆昊+張凱+楊浚哲

摘 要：血細胞作為細胞免疫的承擔者，與體液免疫因子的提供者，在對蝦的免疫系統中具有重要作用。本實驗通過對凡納濱對蝦感染副溶血性弧菌后，總血細胞，大顆粒細胞，小顆粒細胞與透明細胞各自的數量變化與單類血細胞數占總血細胞數的比例變化，發現總血細胞數，三類血細胞數與其各自所占比例在感染的不同時期發生了不同程度的變化，大體呈現先增長后減少的數量變化，探索對蝦的細胞免疫與弧菌感染力的關系，為制定高效的對蝦流行病防控策略提供理論依據。

關鍵詞：凡納濱對蝦；血細胞；大顆粒細胞；小顆粒細胞；透明細胞

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.05.190

1 研究意義和目的

對蝦弧菌病是對蝦養殖中危害嚴重的疾病之一，其中鰻弧菌和副溶血弧菌廣泛存在于自然海水中，具有流行廣、發病率高、危害大、死亡率高等特點，造成對蝦養殖業嚴重的經濟損失。因此，進行對蝦免疫學研究，為建立高效、健康的對蝦養殖模式提供基礎科學依據。對蝦的血細胞既是細胞免疫的承擔者， 又是體液免疫因子的提供者， 分為透明細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞三類， 各自擔負著不同的免疫功能。在健康對蝦體內三類血細胞的比例和數量相對穩定。當對蝦患病后， 三類血細胞的比例和數量會發生相應的變化。

本課題旨在探索對蝦的細胞免疫與弧菌感染力的關系，為制定高效的對蝦流行病防控策略提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

健康的凡納濱對蝦（ Litopenaeus vannamei ） 購自南山市場。副溶血性弧菌（ATCC17802）購自中國菌種保藏中心。

抗凝劑（ NaCl 450mM， KCl 10mM， EDTA-Na2 10mM， HEPES 10mM， pH7.3）與血淋巴等滲。

2.2 預實驗

將十組凡納濱對蝦，每組3尾，分別注射0.1ml不同濃度的副溶血弧菌，記錄各組凡納濱對蝦的死亡時間。選擇接近168小時全部死亡的一組的副溶血弧菌濃度進行下一步實驗。如果死亡時間與理想時間相差過大，則進行多次預實驗。

2.3 對蝦感染試驗

選取體長10cm±0.5cm，體重30g±2g，外觀健康的凡納濱對蝦，暫養于180L水族箱中。一周后，感染組取30尾注射副溶血性弧菌，對照組取30尾注射等量生理鹽水。兩組分別飼養，每日投喂飼料一次。實驗過程連續充氣，水溫為24℃-26℃。

2.4 血樣的制備

注射弧菌后，用配有26號針頭的1ml注射器從實驗組3尾凡納濱對蝦與對照組3尾凡納濱對蝦的腹血竇處分別取0.4ml血淋巴。

取血前在注射器中裝入0.4ml的抗凝劑（4℃），取血后將血淋巴和抗凝劑的混合物注入裝有0.4ml抗凝劑的離心管中，混勻，混合液用于蝦總血細胞與單類血細胞數的測量。

2.5 血細胞計數

取一滴A液加到血球計數板上在400倍顯微鏡下觀察計數血細胞并計算蝦總血細胞與單類血細胞數，此后每隔12小時重復取血并觀察，直至實驗組凡納濱對蝦全部死亡。

3 結果

3.1 總血細胞計數及比較結果

72小時內血細胞總數呈上升趨勢，72小時后直至對蝦死亡血細胞總數呈下降趨勢。血細胞最多時上升到對照組凡納濱對蝦血細胞總數的232%。108小時后血樣開始模糊不清，死亡的細胞數增多。

3.2 單類血細胞數計數及比較結果

大顆粒細胞：60小時內大顆粒細胞數呈上升趨勢，60小時后直至對蝦死亡大顆粒細胞數不斷下降。未感染弧菌時，大顆粒細胞數占血細胞總數的14.91%，60小時內，其所占比例呈上升趨勢，最高時達到46.74%。此后其所占比例呈下降趨勢，最后一次測量時，比例下降到30.25%。

小顆粒細胞：84小時內小顆粒細胞數呈上升趨勢，84小時后直至對蝦死亡小顆粒細胞數不斷下降。92小時至120小時時下降速度最快。

透明細胞：72小時內透明細胞數呈上升趨勢，72小時后直至對蝦死亡透明細胞數不斷下降。未感染弧菌時透明細胞數在血細胞總數中所占比例最大為51.20%，72小時內其所占比例不斷下降，72小時時最低，達到35.22%，此后有所回升，最后一次測量時，比例達到50.65%

4 總結

對蝦的三類血細胞在免疫中具有不同的功能。本研究發現，在對蝦感染弧菌初期，總血細胞數量和單類血細胞數量都發生了顯著的升高，說明感染弧菌后三類血細胞參與了對抗弧菌的細胞免疫反應。隨著感染時間的增加，對蝦的血細胞數量發生顯著的下降。

可以推斷，對蝦在抵抗弧菌的過程中，其先天免疫系統表現為先強后抑的規律。對蝦抵抗副溶血性弧菌時，三類血細胞數量和比例上的變化規律的發現為制定對蝦流行病防控的高效策略提供理論依據，具有重要意義。

參考文獻：

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指導老師：姜國建，白曉歌