順鉑致大鼠急性腎損傷腎組織細胞凋亡及NGAL的相關性研究

孟曉燕　黃雯靜　陽延松　舒婷婷　楊浩強

【摘要】 目的：研究順鉑（Cisplatin，CDDP）致大鼠急性腎損傷（AKI）模型中腎組織細胞凋亡及腎組織中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）變化及相關性。方法：將36只健康雄性Wistar大鼠隨機分為鹽水對照組（CN組）與順鉑模型組（CP組），CP組為腹腔單次注射順鉑10 mg/kg，CN組腹腔注射同順鉑組等容量生理鹽水，觀察應用順鉑后12、24、48、96、144 h各組大鼠血清肌酐（Scr），腎組織細胞凋亡及NGAL變化。結果：與CN組相比，CP組48 Scr開始升高，144 h達峰值；CP組12 h腎組織凋亡細胞開始增多，48 h增加最明顯；CP組12 h NGAL在腎小管上皮細胞中表達增強（P<0.05），48 h表達最明顯。腎組織細胞凋亡同NGAL表達顯著相關（r=0.925，P<0.01）。結論：細胞凋亡可能是CDDP致大鼠AKI早期致病機制之一，NGAL不僅是早期腎損傷的標記物，還可能參與AKI發病機制。

【關鍵詞】 順鉑； 急性腎損傷； 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白； 細胞凋亡

Relationship between Apoptosis of Renal Tubular Epithelial Cells and NGAL in the Rodent Model of Cisplatin Induced Acute Kidney Injury/MENG Xiao-yan，HUANG Wen-jing，YANG Yan-song，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（05）：049-052

【Abstract】 Objective：To observe the relationship between apoptosis of renal tubular epithelial cells and NGAL in the rodent model of Cisplatin induced acute kidney injury.Method：A total of 36 male wistar rats were randomly assigned to different groups.The rats of CP group were injected once intraperitoneal with Cisplatin at

10 mg/kg，the rats of CN group were injected intraperitoneal with same volume of normal saline vehicle.Rats were euthanized at 12，24，48，96 and 144 hours（n=6 in the CP group at each time point）.The blood and renal tissue specimens were analyzed at each time point.Result：Significant elevations of creatnine in serum were noted by 48 hours in the CP group versus CN group，peak levels were seen on 144 hours（P<0.05）.A significant increased expression of NGAL in renal tissue sections was noted by 12 hours in the CP group versus CN group，the most obvious expression of NGAL was seen on 48 hours（P<0.05）.In addition，renal epithelial cells apoptosis was noted by 12 hours in the CP group versus CN group，peak level was seen on 48 hours（P<0.05）.Apoptosis of renal tubular epithelial cells and NGAL expression was significantly correlated （r=0.925，P<0.01）.Conclusion：Apoptosis may be involved in the early pathogenesis of AKI induced by CDDP in rodent modals，NGAL is not only a biomarker of early renal injury，but also may be involved in the pathogenesis of AKI.

【Key words】 Cisplatin； Acute kidney injury； Neutrophil gelatinase-associated lipocalin； Cell apoptosis

First-authors address：The Fourth Affiliated Hospital，Guangxi University，Liuzhou 545005，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.05.012

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是常見的內科疾病，也是急危重癥常見的合并癥，與較高的死亡率和不良預后相關[1]。關于我國AKI的一項橫斷面研究指出，2013年我國有（140～290）萬AKI患者住院，AKI住院死亡率達12.4%，而71.6%的患者在診斷AKI時或之前有腎毒性藥物應用[2]。提示藥物相關性AKI可能已經成為我國巨大的醫療負擔。

順鉑（Cisplatin，CDDP）是一種廣泛應用的抗癌藥物，劑量相關的腎毒性大大限制了其臨床應用，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）是有前景的AKI早期損傷標記物，前期的工作也發現，CDDP致大鼠AKI早期即存在血、尿NGAL升高[3]，目前關于NGAL研究主要集中于作為早期診斷，預后評估的生物學標記物及參與疾病發病兩方面，在生理情況下或不同的疾病病程中，NGAL扮演著不同甚至截然相反的角色，國內不少研究僅關注于NGAL的早期診斷特性，忽略其生理特性及在疾病發病機制中的角色。本研究通過建立CDDP致大鼠AKI模型，觀察腎組織細胞凋亡及腎組織NGAL變化，探討其相關性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠36只，體重200～220 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 順鉑注射液（江蘇豪森藥業，批號120318），TUNEL試劑盒（美國Roche），NGAL試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立 按隨機數字法將大鼠分為6組，鹽水對照組（CN組），順鉑模型組（CP組），CP組為腹腔單次注射順鉑10 mg/kg，據給藥后各時間點不同分為CP 12 h組、CP 24 h組、CP 48 h組、CP 96 h組、CP 144 h組；CN組為腹腔注射同CP組等容量生理鹽水。每組6只大鼠，共36只。

1.3.2 標本處理 取各時間點大鼠乙醚吸入麻醉，打開腹腔，門靜脈穿刺取血，取血清-80 ℃保存備檢，迅速取出雙腎，去除被膜，生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定過夜，行腎病理切片。

1.4 觀察指標 采用全自動生化儀測定Scr，光鏡下觀察腎組織切片HE染色形態學改變，應用TUNEL檢測腎組織中細胞凋亡情況，免疫組化法檢測腎組織中NGAL表達。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，正態分布計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。相關性分析采用Spearman分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Scr變化 CP組Scr于48 h開始逐漸升高，144 h達峰值（95.8±9.25）μmol/L，見表1。

2.2 腎組織病理變化 與CN組相比，CP組用藥后12、24 h腎小管上皮細胞有輕度濁腫，部分刷狀緣脫落；用藥后48 h，腎小管上皮細胞輕中度濁腫，少量核固縮，見少量蛋白管型形成；至用藥后144 h，腎小管上皮細胞扁平，刷狀緣脫落，管腔擴張，大片細胞核固縮，部分脫落于腎小管腔內。見圖1。

2.3 腎組織NGAL表達情況 每例標本隨機地挑選5個400×視野，應用圖像分析測定NGAL表達的平均光密度。CN組無明顯表達，CP組12 h在皮髓質交界區處腎小管上皮細胞胞漿中表達增強，24、48 h進一步增強（P<0.05），之后表達減弱。見表2和圖2。

2.4 腎組織細胞凋亡情況 應用TUNEL法檢測細胞凋亡，凋亡細胞的細胞核內DNA特異的3末端被特殊標記，呈棕褐色染色。每例標本隨機挑選5個400×視野，計數深棕色細胞核，取平均數計為凋亡細胞數，見表3。腎組織細胞凋亡同NGAL相關性分析提示高度相關，見表4。

3 討論

順鉑是廣泛用于多種實體腫瘤的鉑類抗瘤藥物，腎毒性可出現在約1/3的用藥患者中，既往認為順鉑致AKI的機制可能有炎癥介質、氧化應激、壞死、凋亡、自噬等，早期診治可改善患者預后，而傳統作為AKI的標記血肌酐，受飲食、肌肉質量影響，且屬于“回顧”性指標，敏感性欠佳。近年來關于新的血清及尿液AKI生物標志物的研究逐漸增多，包括NGAL，腎損傷分子1（KIM-1），肝型脂肪酸結合蛋白（L-FABP），白介素18（IL-18），組織型金屬蛋白酶抑制物2（TIMP-2），胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP7），尿外泌體，鈣衛蛋白[4]（calprotectin），Vanin-1[5]以及最近提出的Wnt信號通路中的Wnt4蛋白[6]等，但目前仍沒有足夠的證據證實AKI生物標志物在治療決策中的作用，探討各生物學標記物在AKI中的生物學特性，有助于進一步理解疾病發病機制及尋找治療靶標。

NGAL作為診斷及預后評估的研究涉及炎癥、感染、代謝、心腦血管、呼吸、泌尿、血液等多系統疾病[7-11]。NGAL已知的主要生物學特性是抑菌和調節細胞內鐵貯存，細菌性尿路感染、社區獲得性肺炎、膿毒血癥患者血清以及細菌性腦膜炎腦脊液，細菌性腹膜炎腹水中均可出現NGAL的升高[12]。有研究提出NGAL參與了固有免疫中抗菌性質的鐵耗竭過程[13]。然而，NGAL在一些無菌性疾病中也有表達，提示可能通過結合其他的配體，行使不同功能。

現有研究發現NGAL生物學功能涉及參與炎癥反應、氧化應激、促進細胞凋亡等[14-16]，但有研究發現外源性NGAL有抗凋亡作用[17]，也有關于NGAL抑制未分化甲狀腺癌細胞凋亡的報道[18]，而關于NGAL在順鉑致AKI中同細胞凋亡的相關性如何，尚未見報道。

本研究在CDDP致大鼠AKI動物實驗中觀察到，注射CDDP后12 h腎組織NGAL表達增加，至48 h表達最明顯；而腎組織細胞凋亡在應用CDDP后12 h開始增多，48 h腎組織細胞凋亡最顯著，相關性分析提示腎組織細胞凋亡同NGAL表達高度相關，而Scr在細胞凋亡最顯著的48 h才明顯升高，在細胞凋亡逐漸減少的情況下仍呈上升趨勢，至144 h達峰值，腎臟病理顯示有腎小管壞死，提示除損傷早期的細胞凋亡之外，在AKI不同階段，可能有其他的細胞損傷機制參與AKI的發病。本研究發現腎組織細胞凋亡同NGAL表達高度相關，結合目前已有關于NGAL參與細胞凋亡的報道，在AKI中，NGAL為早期腎損傷標記物之外，是否還參與氧化應激或細胞凋亡，從而在AKI的發病機制中起到一定作用？本研究未對相應的分子機制做深入探討，有待于后續研究。

綜上，目前國內關于NGAL的研究主要集中于早期診斷的生物學標記物方面，需要有更進一步的研究探討NGAL在受損組織器官中的生物學特性，可能為AKI的診治提供更廣闊的前景。

參考文獻

[1] Lewington A J，Cerda J，Mehta R L.Raising awareness of acute kidney injury：a global perspective of a silent killer[J].Kidney Int，2013，84（3）：457-467.

[2] Yang L，Xing G，Wang L，et al.Acute kidney injury in China：a cross-sectional survey[J].Lancet，2015，386（10 002）：1465-1471.

[3]孟曉燕，鄭妮，張敏，等.順鉑致大鼠急性腎損傷血、尿NGAL變化及還原型谷胱甘肽干預的研究[J].中國現代醫學雜志，2014，24（33）：15-18.

[4] Westhoff J H，Fichtner A，Waldherr S，et al.Urinary biomarkers for the differentiation of prerenal and intrinsic pediatric acute kidney injury[J].Pediatr Nephrol，2016，31（12）：2353-2363.

[5] Hosohata K，Ando H，Fujimura A.Urinary vanin-1 as a novel biomarker for early detection of drug-induced acute kidney injury[J].J Pharmacol Exp Ther，2012，341（3）：656-662.

[6] Zhao S L，Wei S Y，Wang Y X，et al.Wnt4 is a novel biomarker for the early detection of kidney tubular injury after ischemia/reperfusion injury[J].Sci Rep，2016，6：32 610.

[7] Chakraborty S，Kaur S，Guha S，et al.The multifaceted roles of neutrophil gelatinase associated lipocalin（NGAL） in inflammation and cancer[J].Biochim Biophys Acta，2012，1826（1）：129-169.

[8] Mishra J，Dent C，Tarabishi R，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL） as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery[J].Lancet，2005，365（9466）：1231-1238.

[9] Parikh C R，Coca S G，Thiessen-Philbrook H，et al.

Postoperative biomarkers predict acute kidney injury and poor outcomes after adult cardiac surgery[J].J Am Soc Nephrol，2011，22（9）：1748-1757.

[10] Parikh C R，Devarajan P，Zappitelli M，et al.Postoperative biomarkers predict acute kidney injury and poor outcomes after pediatric cardiac surgery[J].J Am Soc Nephrol，2011，22（9）：1737-1747.

[11] Torres-Salido M T，Cortes-Hernandez J，Vidal X，et al.

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a biomarker for lupus nephritis[J].Nephrol Dial Transplant，2014，29（9）：1740-1749.

[12] Nasioudis D，Witkin S S.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin and innate immune responses to bacterial infections[J].Med Microbiol Immunol，2015，204（4）：471-479.

[13] Goetz D H，Holmes M A，Borregaard N，et al.The neutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes with siderophore-mediated iron acquisition[J].Mol Cell，2002，10（5）：1033-1043.

[12] Cowland J B，Sorensen O E，Sehested M，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin is up-regulated in human epithelial cells by IL-1 beta，but not by TNF-alpha[J].J Immunol，2003，171（12）：6630-6639.

[13] Aigner F，Maier H T，Schwelberger H G，et al.Lipocalin-2 regulates the inflammatory response during ischemia and reperfusion of the transplanted heart[J].Am J Transplant，2007，7（4）：779-788.

[14] Bahmani P，Halabian R，Rouhbakhsh M，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin induces the expression of heme oxygenase-1 and superoxide dismutase 1，2[J].Cell Stress Chaperones，2010，15（4）：395-403.

[15] Nelson A M，Zhao W，Gilliland K L，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin mediates 13-cis retinoic acid-induced apoptosis of human sebaceous gland cells[J].J Clin Invest，2008，118（4）：1468-1478.

[16] Pawar R D，Pitashny M，Gindea S，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin is instrumental in the pathogenesis of antibody-mediated nephritis in mice[J].Arthritis Rheum，2012，64（5）：1620-1631.

[17] Mishra J，Mori K，Ma Q，et al.Amelioration of ischemic acute renal injury by neutrophil gelatinase-associated lipocalin[J].J Am Soc Nephrol，2004，15（12）：3073-3082.

[18] Iannetti A，Pacifico F，Acquaviva R，et al.The neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL），a NF-kappaB-regulated gene，is a survival factor for thyroid neoplastic cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（37）：14 058-14 063.

（收稿日期：2016-12-22） （本文編輯：程旭然）