超聲波協同酶法提取錦燈籠果實多糖工藝的研究*

閆 平，張 彥，張 寒，申旭霽，張明慧

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

錦燈籠是茄科植物酸漿干燥宿萼或帶果實的宿萼。宿萼味苦，氣微，果實味甘，性寒，微酸，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用；外治天皰瘡、濕疹。錦燈籠主要化學成分含有甾體類、生物堿類、黃酮類、多糖、豐富的礦物元素和維生素以及多種氨基酸[1-2]。

有研究表明多糖都具有免疫調節、降血糖、降血脂、抗腫瘤等諸多功效[3-4],植物多糖結構復雜，種類多樣，且常與蛋白質、脂質等結合成多糖復合物，給多糖的提取分離帶來一定困難，加之多糖的提取方法和工藝尚未成熟以及效率、成本等多方面的考慮，所以選擇一種合適的提取分離方法對多糖的研究具有重大意義[5]。植物多糖憑借其獨特的生物活性、相對穩定性、耐熱冷性和水溶性等，在保健品、功能飲料、冰淇淋等食品行業及藥品行業都得到了越來越多的應用[6-8]。目前尚未有以超聲波協同纖維素酶法提取錦燈籠果實多糖方面的研究報導。故實驗采用超聲波協同纖維素酶法對錦燈籠果實多糖提取工藝進行優化[9]。超聲波與酶聯合提取多糖，通過將兩種方法結合提取多糖的方式，大大加速了多糖的溶出，具有條件溫和、雜質易除和提取率高等優點。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

錦燈籠：由西安醫學院藥學院生藥教研室馮永輝教授鑒定；D-無水葡萄糖對照品：110833-201205，中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶：10 000 U/g，成都艾科達化學試劑有限公司；苯酚、硫酸、氫氧化鈉等均為分析純，市售。

電子天平：SQP，北京賽多利斯科學儀器有限公司；超聲波清洗器：KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2，北京市永光明醫療儀器廠；循環水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責任公司；干燥箱：101-1，上海市實驗儀器總廠；紫外-可見分光光度計：UV-160A，上海精密儀器廠；酸度計：PHS-3C，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

稱取5 g錦燈籠干燥果實，加入一定量的纖維素酶再加入一定量的純化水，然后調節pH。在超聲波提取后水浴酶解，水浴酶解后90 ℃滅酶30 s，抽濾，得到錦燈籠果實多糖提取液[10]。

1.3 錦燈籠多糖含量測定

1.3.1 標準溶液的配制

精密稱取無水葡萄糖對照品12.5 mg，置250 mL容量瓶中，加純化水適量溶解，然后稀釋至刻度，搖勻，即得0.05 mg/mL的對照品溶液，現用現配。

1.3.2 苯酚溶液的配制

精密稱取苯酚5.001 1 g，加純化水稀釋，待完全溶解，定容至100 mL( 棕色瓶保存),w(苯酚)=5%，放置冰箱內儲存備用。

1.3.3 標準曲線的制備

精密量取1.3.1節標準品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，然后加純化水補至2.0 mL，再各精密加入配制好的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min。置40 ℃水浴中保溫15 min。取出，迅速在冰水浴中冷卻至室溫，然后在490 nm的波長處測定吸光度。以吸光度值A為縱坐標，ρ(葡萄糖)(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。得出回歸方程：y=68x+0.251 8，R2=0.998 3。

1.3.4 樣品分析

精密量取1.0 mL錦燈籠果實提取液用純化水定容至250 mL，然后精密量取1.0 mL稀釋后的溶液，置10 mL具塞試管中，再加純化水1.0 mL。照標準曲線的制備項下的方法，依法測定吸光度。即各精密加入配制的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min。置40 ℃水浴中保溫15 min。取出，迅速在冰水浴中冷卻至室溫，然后在490 nm的波長處測定吸光度。從標準曲線上得出供試品溶液中含葡萄糖的質量，計算提取率[11]。

錦燈籠多糖提取率(%)=nρV0/1 000m×100%

式中，n為稀釋倍數；ρ為錦燈籠多糖提取液的質量濃度，mg/mL；V0為錦燈籠樣品液的總體積，mL；m為稱取的錦燈籠干燥果實的質量，g。

1.3.5 單因素實驗

稱取錦燈籠干燥果實5.0 g，預設料液比(錦燈籠粉末的質量∶水的體積，下同)1∶10 g/mL、w(纖維素酶)=3%、超聲時間30 min、酶解時間60 min、pH=4.0、超聲溫度50 ℃、酶解溫度50 ℃為工藝流程中的常規量，以料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、w(纖維素酶)(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)、超聲時間(10、20、30、40、50、60 min)、酶解時間(30、40、50、60、70、80 min)、pH值(2、3、4、5、6、7)、超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)6個單因素變量替換工藝流程中相應的常規量，按照1.2和1.3.4實驗步驟提取和測定，然后計算錦燈籠提取液多糖得率。

1.3.6 顯著因素的篩選設計

根據單因素實驗確定的料液比、w(纖維素酶)、超聲時間、酶解時間、pH值、超聲溫度6個影響因素的最適條件范圍，采用Minitab 17軟件進行因素水平設計見表1。

表1 Plackett-Burman實驗設計因素水平表及編碼

1.3.7 響應面法優化實驗設計

利用Box-Behnken實驗設計原理[12-14]，以Plackett Burman實驗確定的4個對錦燈籠多糖得率影響顯著的因素，使用Design-Expert8.0.6軟件進行四因素三水平的實驗設計(見表2)，建立數學回歸模型并分析。

表2 響應面分析因素與水平編碼

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

各因素對錦燈籠多糖得率影響情況見表3、表4。

表3 不同處理組對錦燈籠多糖得率的影響

表4不同處理組對錦燈籠多糖得率的影響

酶解時間/min多糖得率/%pH值多糖得率/%超聲溫度/℃多糖得率/%302.5142.45403.24402.8653.54503.71503.1263.15603.54603.5173.36703.18703.54803.62

由表3、表4可見，綜合數據以及能源消耗等方面考慮，料液比選擇1∶10～1∶20 g/mL較為適宜。

酶催化的實質是酶與底物相結合，從而減小反應物的活化能，提高反應的速率。所以，反應速率在很大程度上是取決于酶與底物復合物形成的速率。從酶解效果以及耗材等方面考慮，w(纖維素酶)選在2%～4%較為適宜[15]。

從數據可以看出，超聲時間在30 min時錦燈籠多糖的得率達到最大。綜合能耗等問題，超聲時間選擇在20～40 min較為適宜。

酶解時間從生產效率等方面考慮酶解時間選擇在50～70 min較為適宜。

pH值不同會使得酶與底物結合的速度也不同，這可能是由于酸堿度會影響酶的催化速度以及酶自身的活性。因此，pH值選擇4.0～6.0較為合適。

由數據可以得出，當提取溫度過高時，錦燈籠多糖的提取率會隨著溫度的升高而下降。因此，超聲溫度選擇在40～60 ℃較為適宜。

2.2 Plackett Burman實驗設計及篩選關鍵因素結果

對表1進行實驗設計及結果效應評價，結果見表5、表6。

表5 Plackett Burman實驗設計及響應值

表6 Plackett Burman實驗設計各因素效應評價

1) **表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(P<0.05)；P>0.05為不顯著。

由表6的結果可以看出，影響錦燈籠多糖得率的因素從強到弱排序依次為：C>A>B>D>F>E。其中超聲時間對錦燈籠多糖得率的影響達到極顯著水平，料液比、纖維素酶添加量和酶解時間達到顯著水平，而超聲溫度和pH值對錦燈籠多糖得率的影響不顯著。因此，選擇超聲時間、料液比、纖維素酶添加量和酶解時間這四個因素作為四因素三水平的響應面法優化設計和分析的因素。根據數據分析和節約成本等原則，將超聲溫度和pH值這兩個因素固定在較好水平上，即超聲溫度為50 ℃，pH值為5.0進行后續實驗。

2.3 錦燈籠多糖提取響應面法優化結果

在Plackett Burman實驗結果的基礎上，考察A、B、C、D 對應的x1、x2、x3、x4四個變量對錦燈籠多糖得率的影響，采用響應面法進行優化，結果見表7。

表7 響應面法優化實驗方案及結果

式中，Y為錦燈籠多糖得率，%。

進一步對該模型及回歸系數進行顯著性分析，結果見表8。

表8 回歸方程各項的方差分析

1) 同表6。

由軟件對回歸模型進行數學分析獲得錦燈籠多糖得率的最佳條件為料液比1∶15.586g/mL、w(纖維素酶)為3.4%、超聲時間29.97min和酶解時間59.73min，在此條件下，預測錦燈籠多糖的得率最大理論值為13.91%。

2.4 優化條件下錦燈籠多糖得率的驗證結果

考慮到實際操作的方便性，將上述最佳條件調整為料液比1∶15.6g/mL、w(纖維素酶)=3.4%、超聲時間30min和酶解時間60min，并結合pH=5.0，超聲溫度50 ℃進行3次平行錦燈籠多糖提取實驗，錦燈籠多糖得率(13.77%、13.80%、13.78%)平均值為13.78%。實際值與預測值的RSD(相對標準差)為0.467%，差異不顯著。因此，采用響應面法優化得到的參數基本準確可靠，具有一定的實用價值。

3 結 論

在超聲波協同酶法提取錦燈籠多糖的過程中，料液比、酶添加量、超聲時間、酶解時間、pH值、超聲溫度等因素均對提取率有影響。通過單因素實驗、PlackettBurman實驗和響應面法優化實驗對超聲波協同酶法提取錦燈籠果實多糖的工藝條件進行優化。得到影響錦燈籠多糖得率的4個顯著因素，以及最佳提取工藝條件參數為料液比1∶15.6g/mL、w(纖維素酶)=3.4%、超聲時間30min、酶解時間60min、pH=5.0和超聲溫度50 ℃，錦燈籠多糖得率平均為13.78%，與預測值(13.91%)的相對標準差為0.467%，差異不顯著。

結果表明超聲波協同酶法具有高效、省時等優點，為纖維素酶法聯合超聲波處理技術在錦燈籠多糖提取過程中的應用提供了理論依據。

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