分子生物技術在污水處理系統內硝化菌群研究中的應用探析

蔡金萍

摘 要：在當前的污水處理過程中，重點研究了微生物的處理方式，在污水生物處理的過程中，污水生物處理系統的地位是不可動搖的，但是在過去的研究過程中，對于微生物而言，存在著十分明顯的缺陷，這主要是因為過去采用的技術手段過于單一，以純培養技術為主，這樣只能進行菌種分離，但是在污水生物處理的相關系統中含有較多的微生物菌群，這些菌群中蘊含著眾多的微生物，所以在空間中聚集在一起，微生物并不是單一存在的，而是需要不斷的競爭以及依存才能得到成長，所以在進行菌種分離以后，就無法創造這樣一個空間，由此便出現了分子生物技術。

關鍵詞：硝化菌群；分子生物技術；熒光原位雜交

分子生物技術的應用對于污水生物處理帶來了一定的幫助，是現階段應用比較普遍的一項技術手段，在進行污水生物處理的過程中，主要包含兩個階段，一個階段是硝化，一個階段是反硝化，這兩個階段都是脫氮的主要環節，在硝化過程中，主要的微生物是硝化菌群，其中包含了眾多的微生物離子，在污水生物處理的過程中，主要依靠了生物活性以及穩定的菌群分布兩個主要特點，這樣才能促進污水生物系統中脫氮更加穩定的運行。在應用分子生物技術處理污水中硝化菌群的過程中，已經有相關研究項目對此展開了詳細的分析，本文主要對此加以論述，希望對今后的研究工作帶來一定的幫助。

1 基于FISH技術的分析方法

這一技術的應用主要是在目標微生物的基礎上根據基因的特異性進行排列而成的，在設計的過程中，其中還含有寡核苷酸探針，具有熒光染料的特點，在堿基序列互補性的基礎上，只要經過相應的雜交，就會顯示出熒光信號，這說明雜交成功，在顯微鏡的顯示下，可以對目的基因加以相對定量分析以及定性分析，在典型的FISH技術中，可以選擇具有不同特異性序列的微生物加以檢測，這樣就可以對微生物群中的結構的變化情況進行研究，從而得出應有的信息。這種方法在污水生物系統中的應用是十分普遍的，并且隨著信息技術的發展，這一技術也得到了進一步的完善。

以FISH-MAR技術為例，這一技術是建立在FISH技術基礎之上的，因為單獨采用FISH技術處理生物代謝等問題還存在一定的局限性，所以在現代化的應用過程中建立起了FISH-MAR技術，這一技術是通過顯微照片的形式將生物的復雜性展示出來，清晰的顯示出相應的菌群結構以及空間分布等問題，這一技術的核心在于可以在無機底物中加以培養，并且對具有放射性的細胞進行收集，在影像中所呈現出來的顏色是黑色，具體的實驗流程是先將適量的污泥加入到血清瓶中，然后在血清瓶中加入適量的放射性標記底物，再經過2h的好氧培養，這樣就可以得到污泥樣品，將樣品固定以后加以沖洗，經過FISH程序與MAR程序以后通過顯微鏡進行觀察，得出相應的結論。

這種方式對微生物代謝與微生物群種結構的研究具有重要的意義，但是不足之處在于對目標含量較低的微生物結構來說并不適用，因為這種方式需要建立在熒光信號以及放射自顯影的基礎上，所以在活性污泥中，如果目標微生物的細胞過低，那么就會造成目標微生物的rRNA也具有較低的含量，這樣就會對熒光信號產生一定的影響，不能得到正常的顯影，進而無法準確的檢測出結果。因此，如果硝化菌群無法呈現出優勢菌群的特征時，那么就不適合采用FISH-MAR這一技術，即便是使用了這一方法，也無法獲得顯著的效果。

2 基于PCR技術的分析方法

2.1 amoA與16SrRNA基因

在應用這一技術的過程中，主要是選擇具有進化標記的硝化菌群中的DNA序列進行研究，在這一序列的基礎上，可以得知選擇的分子標記基因為16SrRNA基因以及amoA。在對其進行研究的過程，這一技術所產生的影響是十分深遠的，對于不同的微生物而言，16SrRNA在區域中所具有的差異也是十分明顯的，其中可以分為兩個組成部分，一個組成部分是古細菌，一個組成部分是細菌，在此基礎上對微生物開展了更加深入的分析，在進行微生物分析的過程中，發現基因結構也是具有一定差異性影響的，16SrRNA自身具有保守性以及差異性的特點，通過上述的特點可以對系統發育以及相應的進化距離加以進一步的確定。

大部分AOB在分別基于amoA和16SrRNA基因的系統發育樹上的分類有著高度的相似性。他們同時也發現，盡管對AOB的16SrRNA基因和amoA基因進行定性分析時都可以反映出環境中AOB的種類，但由于不同種AOB之間的16SrRNA基因序列的高度相似性和該類型引物的非特異性，限制了16SrRNA基因類引物對AOB菌群系統發育樹分析的精確度。而盡管amoA不是制定系統發育樹的因子，但由于amoA只存在于AOB中，而且不同種AOB的amoA序列差異度超過其16SrRNA基因的序列差異度，使得amoA類引物的擴增特異性更強，因此對AOB菌群遺傳差異的分辨能力更高，從而能夠更精確地分辯出AOB的種屬。但無論是amoA類引物，還是16SrRNA基因類引物，目前都只針對β-變形菌綱的自養型AOB，因此在使用這兩類引物對AOB進行分析研究時都會低估環境樣品中AOB菌群的多樣性。

2.2 PCR-T-RFLP

PCR-T-RFLP（PCR-terminal restriction fragment length polymorphism，PCR-末端限制性片段長度多態性）技術是對PCR擴增過程中所使用的引物一端用熒光物質進行標記。當用該引物對樣品DNA進行PCR擴增后，PCR的擴增產物就帶有了熒光標記。然后選擇適當的限制性內切酶對PCR產物進行消化，就可產生不同長度的限制性片段。傳統的T-RFLP技術通常只使用一條帶有熒光染料的引物和一種限制性內切酶。隨著該技術的改進，有的研究者會同時使用兩條帶有不同熒光染料的引物進行PCR擴增，從而提高目標微生物的分類水平。最后利用DNA自動測序儀和帶有其它熒光染料標記的內標物對消化產物的長度進行分析，并獲得峰值圖。由于每種微生物帶熒光標記的限制性片段長度唯一，所以峰值圖中每一個峰至少代表一種微生物，每個峰面積與峰總面積的比值代表這種微生物的相對含量。相對于PCR-DGGE技術，PCR-T-RFLP技術能在相對較短的時間內對大量樣品的菌群結構進行分析。PCR-T-RFLP技術還具有較好的重現性和更高的靈敏度，從而該技術能夠對樣品中含量較少的微生物進行研究。

3 結論與展望

分子生物技術在污水生物處理系統內硝化菌群研究中的應用，從微生物學角度更本質地揭示了影響污水生物處理系統硝化性能的因素。本文提到的分子生物技術在污水處理中脫氮除磷相關機理和理論的研究中也有著廣闊的應用前景，如短程脫氮、反硝化除磷、同步硝化反硝化及厭氧氨氧化等。通過這些技術可以識別特定生物代謝過程的微生物種群；建立目標菌群動態變化與工藝運行參數之間的相關關系；從微生物學角度對系統運行狀態給予最直接、最可靠的分析與證明，為污水生物脫氮除磷系統的長期穩定運行奠定理論基礎，提供借鑒與指導。

參考文獻

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