濕地生態(tài)系統(tǒng)反硝化作用及其測定研究

李亞蘭

摘要：指出了當前由于溫室氣體的增加導致全球變暖，“地球之腎”的濕地是對全球氣候變化響應最敏感的區(qū)域之一，其碳氮循環(huán)也成為近年來學術(shù)界研究的熱點。脫氮作用是濕地氮循環(huán)的重要功能，反硝化作用在濕地脫氮作用中占主導地位。綜述了濕地生態(tài)系統(tǒng)反硝化作用測定及計算的一些方法，主要有乙炔抑制法、硝酸鹽剩余法、氣體分壓法、15N同位素技術(shù)法、結(jié)合膜輸入質(zhì)譜檢測的同位素配對法、15N成對標記法。以期為濕地氮循環(huán)研究提供參考。

關鍵詞：濕地生態(tài)系統(tǒng)；氮循環(huán)；反硝化作用；測定方法

中圖分類號：S156.8

文獻標識碼：A文章編號：1674-9944（2016）22-0032-03

1引言

濕地生態(tài)系統(tǒng)脫氮作用對濕地氮循環(huán)有重要意義，而氮素生物地球化學循環(huán)又進一步影響到濕地生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力甚至是全球的氣候變遷，因此脫氮過程反硝化作用是濕地土壤氮素循環(huán)不可缺少的環(huán)節(jié)之一。目前測定反硝化作用的方法有：乙炔抑制法、硝酸鹽剩余法、氣體分壓法、15N同位素技術(shù)[1]、結(jié)合膜輸入質(zhì)譜檢測的同位素配對法、15N成對標記等方法。筆者總結(jié)了每種測定方法的原理、操作方法、運用范圍、優(yōu)缺點和分析精度，以期為實驗提供參考依據(jù)，也為濕地氮循環(huán)尤其是反硝化過程研究奠定基礎。

2濕地生態(tài)系統(tǒng)的反硝化作用

河口區(qū)分布的天然濕地在減少上游徑流向海洋的氮輸入量及降低河口水體富營養(yǎng)化發(fā)生風險及危害方面作用巨大[2]。厭氧環(huán)境下，即水體中常見的含氮污染物（NO-3）可由土壤微生物介導的土壤反硝化過程轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮[3]。目前對濕地生態(tài)系統(tǒng)反硝化作用的研究通常意義是指硝酸鹽或亞硝酸鹽在缺氧條件下被還原為N2、N2O、NO等氣體而進入大氣之中。濕地中通過生物過程特別是脫氮作用被去除的氮可達75%，反硝化作用形成氣體N2O和N2可占去除總氮量的89%～96%，是濕地生態(tài)系統(tǒng)氮去除的主要機制[4，5]。

3反硝化作用的測定方法

3.1乙炔抑制法

乙炔抑制法原理是一定濃度的乙炔抑制N2O還原酶的活性，反硝化過程停留在產(chǎn)N2O過程，將NH+4-N氧化為N2O的硝化作用也被乙炔抑制，根據(jù)N2O產(chǎn)生量通過計算得到反硝化速率[6]。運用氯霉素改善乙炔抑制法，給培養(yǎng)土添加氯霉素、硝酸鉀、葡萄糖可以使反應更充分[7]。

缺點是培養(yǎng)過程中土壤酶被氯霉素抑制導致乙炔濃度變小，乙炔對N2O到N2這一過程所起的抑制作用降低；乙炔純度難保證，反硝化速率測定結(jié)果不準確；土壤中硝態(tài)氮濃度較低碳含量較高時乙炔抑制劑會失去其抑制作用[8]。當土壤NO3-N含量較低時不可采取乙炔抑制法測定其反硝化速率。但乙炔抑制法在靈敏度、重現(xiàn)性、培養(yǎng)時間等方面存在獨有優(yōu)勢。

3.2硝酸鹽剩余法

硝酸鹽剩余法原理是在所培養(yǎng)的土壤中定量添加硝態(tài)氮，樣品中硝態(tài)氮含量在不同的培養(yǎng)階段取樣并測定，然后計算各個培養(yǎng)階段硝態(tài)氮的變化量，用硝態(tài)氮變化量除以培養(yǎng)時間來計算反硝化速率，用硝態(tài)氮變化量除以初始量來計算其活性，培養(yǎng)過程需要保證厭氧淹水[9]。

優(yōu)點是反硝化活性和速率可同時測定，缺點是部分NO3-N進入到土壤中后在短時間內(nèi)被束縛無法參加反應[10]，測定結(jié)果可能高估土壤反硝化作用。

3.3氣體分壓法

氣壓過程分離技術(shù)（BaPS）即氣體分壓法是Ingwersen在1999年提出的[11]。原理是設定土壤僅有的反應過程是CO2溶于土壤水的過程、土壤硝化反硝化過程和土壤呼吸過程，則在土壤呼吸系數(shù)為1.0的條件下，可根據(jù)氣壓平衡原理計算反硝化速率。即測量氣室氣壓變化和O2和CO2濃度變化推出反硝化速率。其優(yōu)缺點為：①缺點是保持土壤呼吸系數(shù)為1.0，因此測定通氣狀況不好或太好的土壤反硝化速率將產(chǎn)生偏差，淹水土壤反硝化速率的測定則不適宜使用氣體分壓法。②優(yōu)點是迅速、易做、無污染、可同時測得N2O釋放速率和反硝化速率、與其它氣體抑制劑添加和15Ncompoundtothesoil方法比減少了對土壤系統(tǒng)的干擾。

3.415N同位素技術(shù)

（1）15N平衡差值法。施入培養(yǎng)土壤的15N肥料總量-氨揮發(fā)的15N量-植物吸收的15N量-土壤殘留的15N量=反硝化損失量。優(yōu)點是氨揮發(fā)的15N和15N豐度測定真實，測定結(jié)果在沒有徑流和淋洗損失時可信，缺點是測出的值比實際值稍低，生物交換作用使土壤本身所含的氮與施入的15N進行交換[12]。

（2）氣體通量法（15N示蹤）。給土壤樣品施標有15N的肥，同時測定定期從樣品中采集的氣體，所采樣品中的CO2、O2雜質(zhì)要在測定前去掉，將氮氧化物定量還原成N2，用15N示蹤-質(zhì)譜法測定[13]。此方法可適用于沉積物和原位土壤的植物不能被破壞的條件，并且靈敏度高。

3.515N成對標記

成對標記的原理是向培養(yǎng)器中添加15NO-3，在添加之前和之后分別測定15NO-3和14NO-3比率。在培養(yǎng)初期、中期、后期測定29N2和30N2隨時間的線性變化。水溶液中加入飽和HgCl2溶液，待測N2的氣體通過高溫燃燒去除O2，最后通過公式計算得出反硝化的速率[14]。

15D=p29N2+p2×（30N2）

14D=（p29N2）/（2×p（30N2）×15D

Dtot=15D+14D

式中15D指加了15NO-3后，從29N2和30N2產(chǎn)率中得到15N2的產(chǎn)量；p指產(chǎn)量。

其優(yōu)點是國內(nèi)外普遍認可的新方法，此方法適用于河口沼澤濕地反硝化的測量，同時也適用于DNAR。但在沉積物反硝化速率的測定中貢獻不明顯。

3.6結(jié)合膜輸入質(zhì)譜檢測的同位素配對法

將從河口濕地采集的土柱放入培養(yǎng)器中，從中采集出水樣并將水樣放入培養(yǎng)皿中，每間隔40min加入N2進行溶解并通過4min震蕩使其達到均衡的培養(yǎng)，氣體樣品的抽取在水樣之前，采用注射器在培養(yǎng)器中抽取氣體到3.5mL的收集管中，給樣品中注入15NO-3，并使其濃度在100μmol/L左右，14NO-3只保持原有的豐度[15]。然后用同位素率mass光譜儀分析14N15N/15N15N的比率，可以顯示出15NO-3與14NO-3之間的平衡狀況，15NO-3（D15）和14NO-3（D14）的反硝化速率可以通過公式計算得出。

這種方法適用于室內(nèi)模擬培養(yǎng)實驗，通過15NO-3的添加可更詳細的測出各部分的產(chǎn)生物，但程序復雜，需長時間測量。

4結(jié)語

隨著全球氣候變暖和極端氣候現(xiàn)象增多，人們對于氣候的變化越來越關注。濕地生態(tài)系統(tǒng)對氣候具有調(diào)節(jié)作用，其氮循環(huán)過程的重要環(huán)節(jié)反硝化作用測定和計算方法在不斷修改和進步，這有利于對氮循環(huán)過程產(chǎn)生的溫室氣體N2O的進一步研究。在研究溫室氣體N2O的過程中發(fā)現(xiàn)實驗條件的不同以及實驗進行過程眾多的影響因子要求有不同的實驗方法和實驗設置以保證實驗成果的準確性，因此對于測定反硝化的方法要求更高。筆者綜述了以上幾種反硝化測定方法，可以看出，每一種方法都有它自身的優(yōu)缺點和適宜范圍，需要實驗者更好地利用其優(yōu)點，發(fā)揮其有利的價值。

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