星點設計-響應面法優化知母總皂苷提取工藝

孫士林(西北民族大學 化工學院， 甘肅 蘭州 730030)

星點設計-響應面法優化知母總皂苷提取工藝

孫士林(西北民族大學 化工學院， 甘肅 蘭州 730030)

目的：采用星點設計-響應面法優化知母總皂苷提取工藝。方法：以知母皂苷元為指標，選取乙醇作為提取溶劑，以乙醇濃度、固液比、提取時間、提取次數為自變量，知母總皂苷提取效率為因變量，采用星點設計-響應面法對知母總皂苷提取工藝參數進行優化。結果：確定了知母總皂苷提取最佳條件：乙醇濃度70%、固液比1:6、提取時間75分鐘、2次提取為最優條件。結論：該工藝可用于知母總皂苷提取，工藝流程簡單，預測性好。

知母；響應面法；星點設計；知母總皂苷；提取工藝

中 藥 知 母 為 百 合 科 植 物 知 母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)的干燥根莖，史載于《神農本草經》，具有清熱瀉火、生津潤燥的功效，用于治療溫熱病，邪熱亢盛、壯熱、煩渴[1]。知母為常用大宗“道地”中藥材,產自河北歷縣，習稱“西陵知母”。知母根莖中含大量甾體皂苷，已分離鑒定出多種皂苷。知母總皂苷元能明顯降低衰老小鼠腦β受體cAMP系統的反應性，重現知母的下調作用，是由知母藥材經水解提取精制而成[2]。目前對知母的利用基本上停留在作為處方藥材進行簡單的丸劑、散劑、制劑加工，對于其中有效成分知母總皂苷元的提取、純化以及加工利用程度還遠遠不夠。

知母總皂苷提取工藝的工業化生產有深遠的意義,深圳太太藥業股份有限公司近年已將知母皂苷元開發成為一個中藥二類新藥，主要治療現代醫學中老年癡呆癥和學習、記憶減退或某些性格改變等腦功能減退癥狀，因此,就目前而言，知母總皂苷提取方法有：大孔樹脂吸附法母制劑[3]、水解法[4]、膜分離法[5]以及溶劑提取法，前四種方法雖然相對溶劑提取法而言有提取效率高、純度大的優點但其成本造價太高、操作相對繁瑣不適宜工業生產采用，因此溶劑提取法仍然作為現如今知母皂苷生產常用方法。知母皂苷化合物分子量較大,易溶于熱水、乙醇等極性溶劑[6]，就知母皂苷提取而言，知母皂苷受提取條件影響大，故而篩選出最優條件對知母皂苷生產有重要意義。本實驗采用星點設計對知母總皂苷提取工藝外部條件進行篩選，再結合Design-Expert 8.0.6軟件進行電腦模擬預測，回歸現實實驗驗證，篩選出知母總皂苷提取條件，為知母的開發及工業化提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

西陵知母(產自河北易縣)，知母皂苷元標準品(含量98%，購自上海譜振生物科技有限公司，批號：ZY161102)，乙醇、甲醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等均為國產市售AR級試劑。

1.2 儀器

電子分析天平(FA1204B上海精科)，紫外可見分光光度計(Heλiosβ 美國熱電)，旋轉蒸發儀(RE-52C 常州諾基)，水浴鍋。

2 方法與結果

2.1 知母總皂苷含量測定

2.1.1 對照溶液制備

取知母皂苷元標準品適量，加甲醇定容至50ml棕色容量瓶留用。

2.1.2 供試品溶液制備

取干燥知母根莖，粉碎，過20目藥篩，取10g知母粉，加入60ml70%乙醇，精密稱重并于60℃水浴回流提取1h，補足重量，提取液過濾，取10ml濃縮至干，取分析純溶劑溶解并定容至100ml容量瓶。于10ml容量瓶中添加0.2ml高氯酸、0.8ml5%香草醛-冰醋酸溶液，以上述溶液進行定容，60℃恒溫水浴顯色20min，取出立即冰浴5min，靜置10min，于430nm波長處測量吸光度A。

2.1.3 最大吸收波長的確定[3]

精密吸取2.1.1中知母皂苷元對照溶液，采用2.1.2中顯色方法進行顯色，以試劑為空白對照，在200-1000nm波長范圍掃描，結果為430nm處吸光度最大，故以430nm為最大吸收波長。

2.1.4 標準曲線制備[4]

精密移取標準品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml于10ml容量瓶，按照2.1.2顯示方法進行顯色，以無水甲醇進行定容。以無水甲醇按照上述方法進行顯色最為對照。于430nm波長處測定紫外吸收。標準品加入量為橫坐標，吸光度為縱坐標，計算回歸方程。

2.1.5 穩定性試驗

取同一樣品按照2.1.3進行操作，每隔10min測定一次，結果表明在30min內同一樣品測定結果基本穩定。

2.1.6 精密度試驗

取5份同一樣品，按2.1.2操作方法進行紫外吸收測定，連續進樣5次，測定其RSD值為1.0%，結果表明本方法精密度好。

2.1.7 重現性試驗

按2.1.2操作平行制備5份樣品，每份吸取1.0ml，測定紫外，RSD值為1.1%，表明重現性好。

2.1.8 回收實驗

取已知知母總皂苷含量的知母粉5份，每份10g，分別加入適量知母皂苷元對照品，進行回流提取，濾液定容至10ml容量瓶。按2.1.2處理，并且顯色。結果顯示知母總皂苷的平均加樣回收率為98.2%。

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取溶劑濃度對知母總皂苷提取的影響

按照2.1.2操作，分別取溶劑濃度50%、60%、70%、80%、90%，固液比1:6，提取1次，提取60min，并按照2.1.2顯色、測定紫外吸收。

測定結果如圖1所示，通過圖一可以看出當乙醇濃度上升時，知母總皂苷提取率上升，當上升到一定程度時開始下降，最適濃度為70%，此時知母總皂苷提取效果最優，提取率為64.2mg/g。

圖1 乙醇濃度對提取率影響

2.2.2 固液比對知母總皂苷提取的影響

選取乙醇濃度70%，提取時間為60min，提取一次，固液比分別取1:3、1:4,、1:5、1:6、1:7、1:8、1:10，按照2.1.2操作進行提取以及顯色。測定知母總皂苷提取率，隨著固液比的上升，知母總皂苷提取效果呈現上升趨勢，當固液比1:6時，知母總皂苷提取率隨著固液比增加提取效果變化最大。當固液比超過1:6時，知母總皂苷提取效果變化趨勢不大，從節約成本考慮，固液比1:6為最適固液比。

2.2.3 提取次數對知母總皂苷提取影響

選取乙醇濃度70%、固液比1:6，提取時間為60min，提取次數分別為1、2、3、4、5次，按2.1.2操作進行處理及顯色。測定知母總皂苷提取率，隨著提取次數的增加，知母總皂苷提取效果在1到2次時變化最為明顯，在3次以后變化趨勢不明顯，故而可以認定提取次數為2次時知母總皂苷提取效率最優。

2.2.4 提取時間對知母總皂苷提取影響

選取乙醇濃度70%、固液比1:6，提取次數2次，提取時間分別為30、60、90、120、150min，按2.1.2進行處理及顯色操作。測定知母總皂苷提取率，隨著提取時間的增加，知母總皂苷提取效果相對應產生變化，在提取時間大約為80min時，知母總皂苷提取效果達到最大，當提取時間再次增加時，提取效率反而下降。因此確定知母總皂苷提取時間80min最佳。

圖3 提取次數與提取率

2.3 響應面法優化知母總皂苷提取率

根據星點實驗設計，選取提取溶劑濃度、提取次數、提取時間為三個考察因素，以知母總皂苷提取率為因變量，以Design-Expert 8.0.6軟件實驗設計的三因素三水平實驗方案進行研究。

表2 實驗因素水平編碼

圖4 星點設計及結果

2.3.1 模擬方程建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對上表數據進行方差分析，得回歸方程：Y=-351.48733+6.52578*X1+132.86326X2 +2.12981*X3-0.29400*X1X2--003*X1 *X3+0.021960*X2*X3-0.032937* X12-25.30811* X22-003*X32。其中，方程中各變量對響應值影響的顯著性可從F檢驗，prod>F值越小，則相應的顯著程度越好。

2.3.2 工藝參數優化與預測

根據響應面軟件實驗設計所得結果計算出最佳提取工藝條件：乙醇濃度70%，提取次數2次，提取時間75min。(分析結果見附圖)

2.3.3 實際驗證試驗

根據響應面軟件預測結果，進行5次最佳條件下的提取驗證，結果表明，知母總皂苷提取率達到150.337mg/g，相比于預測結果降低1.231%，表明結果達到模型預測效果。

3 討論

本實驗通過對提取溶劑濃度、提取時間、提取次數、固液比單因素對知母總皂苷提取率影響的考察，確定主要影響因素，利用Desig Expert 8.0.6 軟件進行響應實驗設計，進行試驗預測，通過實際驗證確定了知母總皂苷最佳提取工藝：乙醇濃度70%，提取兩次，提取75min為最佳提取條件，單因素實驗確定了最佳固液比1:6。整個提取工藝流程簡單，提取率高，可為后續知母產業工業化提供理論依據。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015.205-206.

[2]趙樹進，韓麗萍，李儉洪.知母皂苷及其苷元對動物模型β腎上腺素受體的調整作用[J].中國醫院藥學雜志，2000，20(2)：70-73.

[3]韓麗萍，趙樹進，李儉洪，大孔樹脂法提取知母總皂苷[J].中藥材，2004，27(4)：288-289.

[4]陳叢瑾，黃克瀛，崗建偉，等.知母總皂苷元的提取工藝研究[J].應用化學，2007，36(2)：87-88.

[5]吳妍.知母提取物的提取及制劑工藝研究[J].廣東:廣東藥學院，2008，5.

[6]高帥.知母活性成分提取工藝優化及降糖活性研究[D].杭州：浙江工業大學，2013.

附圖