鈉氫交換蛋白1抑制劑對嚴(yán)重?zé)齻蠖嗯K器損傷大鼠的保護(hù)作用研究

李文鵬，趙高煬，楊薛康，馬 騰

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

·論著·

鈉氫交換蛋白1抑制劑對嚴(yán)重?zé)齻蠖嗯K器損傷大鼠的保護(hù)作用研究

李文鵬，趙高煬，楊薛康，馬 騰

目的探討鈉氫交換蛋白1(NHE1)抑制劑對嚴(yán)重?zé)齻笕矶嗯K器功能損傷大鼠的保護(hù)作用，并探討其潛在的機(jī)制。方法常規(guī)方法建立30%體表面積燙傷的大鼠模型。用NHE1抑制劑(卡立泊來德)干預(yù)后，通過觀察組織病理學(xué)及炎癥因子的改變來探討NHE1在燒傷后多臟器損傷時(shí)所起的作用。結(jié)果NHE1在燒傷后大量表達(dá)，而NHE1的抑制劑可顯著減輕燒傷后心臟、肺臟、腎臟及小腸的損傷。同時(shí)NHE1抑制劑也可以降低腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、髓過氧化物酶(MPO)水平。結(jié)論NHE1抑制劑顯著減輕燒傷后大鼠多臟器損傷，其部分機(jī)制可能是抑制了組織的炎癥反應(yīng)。

燒傷；多臟器損傷；鈉氫交換蛋白1；炎癥；大鼠

燒傷是一種常見的損傷，嚴(yán)重?zé)齻梢l(fā)一系列炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致多臟器功能損傷死亡率增高[1-2]。因此，有效地減輕組織炎癥反應(yīng)，是治療燒傷后多臟器功能損傷、降低燒傷后致死率的主要策略。鈉氫交換蛋白1(Na+/H-exchanger 1, NHE1)是一種跨膜蛋白，廣泛存在于所有真核細(xì)胞表面，在機(jī)體多種臟器的缺血再灌注損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3-5]。近年來，有大量研究表明NHE1可調(diào)控中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞，進(jìn)而介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，對NHE1的抑制可顯著減少促炎因子釋放，減輕組織炎癥反應(yīng)[4-8]。但對NHE1的抑制是否可降低燒傷后炎癥反應(yīng)，從而減輕燒傷后多臟器功能損傷，目前還不明確。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過大鼠燙傷模型，觀察NHE1在燒傷后多臟器功能損傷中起的作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康無特殊病原體級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量200～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。試劑：NHE1特異性抑制劑(卡立泊來德)為德國Hoechst公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷、氯仿、甲醇、蔗糖、抗壞血酸、硫酸亞鐵和四氯化碳等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑均為國產(chǎn)AR 試劑。

1.2 動物準(zhǔn)備 大鼠麻醉后脫毛，左側(cè)頸動脈置管測量動脈血壓、左心室收縮壓(LVSP )和左心室收縮壓下降水平(LV+dP/dtmax )并進(jìn)行記錄。完成上述步驟后將大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分成3組：對照組、燙傷組和治療組，每組10 只。將燙傷組與治療組大鼠放入特制的容器中，于100 ℃水中水浴12 s，造成30% TBSA Ⅲ度燙傷(通過病理切片證實(shí))，根據(jù)補(bǔ)液公式補(bǔ)液并鎮(zhèn)痛。對照組于25 ℃水中水浴12 s，其余操作均與燙傷組相同。治療組給予NHE1抑制劑(5 mg/kg )。24 h后處死各組大鼠。

表1 燙傷大鼠NHE1抑制劑處理后心功能相關(guān)指標(biāo)的變化(x±s)

注：與對照組相比aP<0.01；與燙傷組相比bP<0.01。LVSP為左心室收縮壓，LV+dp/dtmax為左心室收縮壓下降水平，LDH為乳酸脫氧酶，CK為肌酸激酶，CK-MB為肌酸激酶同工酶，NHE1為鈉氫交換蛋白1。1 mmHg=0.133 kPa

1.3 指標(biāo)測定 心肌損傷和腎臟指標(biāo)：包括血清乳酸脫氫酶(LDH )、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)應(yīng)用全自動生化分析儀(Olympus)檢測。炎癥指標(biāo)：包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、髓過氧化物酶(MPO )水平，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定，同時(shí)結(jié)合分光光度計(jì)法測定。組織學(xué)損傷采用病理切片結(jié)合蘇木精染色觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 11.0軟件，P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NHE1抑制劑可有效抑制NHE1的表達(dá) 與對照組相比，燙傷組大鼠血清NHE1mRNA表達(dá)水平有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )，提示燙傷后NHE1表達(dá)活化；與燙傷組相比，治療組血清NHE1mRNA 表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )，提示NHE1抑制劑有效抑制了NHE1的表達(dá)。見圖1。

注：與對照組相比aP<0.01；與燙傷組相比bP<0.01

2.2 NHE1抑制劑可有效減輕燒傷后心臟損傷 與對照組相比，燙傷組大鼠LVSP和LV+dP/dtmax顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )；治療組大鼠LVSP 和LV+dP/dtmax 則顯著高于燙傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )。與對照組相比，燙傷組大鼠心肌酶LDH 、CK和CK-MB顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )；治療組大鼠上述指標(biāo)較燙傷組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )。見表1。

2.3 NHE1抑制劑可有效減輕燒傷后肺損傷 與對照組(圖2A)相比，燙傷組(圖2B)肺組織中可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，組織間隙明顯水腫，并可見紅細(xì)胞的滲出；而以上病理特征在治療組(圖2C)中可見到顯著的改善。見圖2。

注：A：對照組大鼠肺組織無明顯異常；B：燙傷組大鼠肺組織大量炎癥細(xì)胞浸潤，組織間隙水腫，可見大量紅細(xì)胞滲出；C：治療組大鼠肺組織炎癥細(xì)胞減少，組織間隙水腫減輕，少量紅細(xì)胞滲出。NHE1為鈉氫交換蛋白1

2.4 NHE1抑制劑可有效減輕燒傷后腸道損傷 與對照組(圖3A)比較，燙傷組(圖3B)大鼠腸黏膜可見大量炎性細(xì)胞滲出，黏膜潰瘍以及黏膜壞死。而治療組(圖3C)的病理情況可見顯著改善。見圖3。

注：A：對照組大鼠腸組織無明顯異常；B：燙傷組大鼠腸組織大量炎癥細(xì)胞浸潤，可見黏膜潰瘍以及黏膜壞死；C：治療組大鼠腸組織炎癥細(xì)胞減少，散在小潰瘍，無明顯黏膜壞死。NHE1為鈉氫交換蛋白1

2.5 NHE1抑制劑減輕了燒傷后腎臟損傷 與對照組相比，燙傷組BUN 和Cr 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )；而治療組BUN 和Cr 水平則顯著低于燙傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )。見表2。在組織病理方面(圖3)，與對照組(圖3A)相比，燙傷組(圖3B)腎小管中出現(xiàn)許多管型，并有腎小球腫脹和血管充血的改變。而治療組(圖3C)的病理損傷均有所改善。

表2 燙傷大鼠NHE1抑制劑處理后血肌酐、BUN 含量及腎臟微血管通透性的變化(x±s)

注：與對照組相比aP<0.01；與燙傷組相比bP<0.01。BUN為血尿素氮，Cr為血肌酐，NHE1為鈉氫交換蛋白1

注：A：對照組大鼠腎組織無明顯異常；B：燙傷組大鼠腎小管中出現(xiàn)許多管型，并有腎小球腫脹和血管充血的改變；C：治療組大鼠腎小管中管型減少，腎小球腫脹和血管充血減輕。NHE1為鈉氫交換蛋白1

2.6 NHE1抑制劑減輕了全身炎癥反應(yīng) 與對照組相比，燙傷組大鼠血清中IL-6 、TNF-α、MPO 的水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )，說明燙傷后炎癥反應(yīng)加重。而治療組大鼠上述炎癥因子水平則低于燙傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 )，說明NHE1抑制劑減輕了炎癥反應(yīng)。見表3。

表3 燙傷大鼠NHE1抑制劑處理后血清中炎性因子的變化(x±s)

注：與對照組相比aP<0.01；與燙傷組相比bP<0.01。TNF為腫瘤壞死因子，IL為白細(xì)胞介素，MPO為髓過氧化物酶

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NHE1抑制劑顯著減輕了嚴(yán)重?zé)齻蠖嗯K器功能損傷，并對其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

NHE1是一種跨膜蛋白，廣泛存在于所有真核細(xì)胞表面，參與介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種功能，在組織缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。近年來發(fā)現(xiàn)NHE1在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用，可以介導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞的活化與凋亡，NHE1與炎癥的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)[9-10]。越來越多的研究顯示，在創(chuàng)傷性休克模型中，通過對NHE1的抑制可顯著降低促炎細(xì)胞因子的釋放，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對心臟、肺臟、肝臟和腎臟發(fā)揮保護(hù)作用[4-8]。

嚴(yán)重?zé)齻蠖嗯K器損傷的機(jī)制非常復(fù)雜，以往的研究認(rèn)為組織的缺血再灌注損傷是主要原因，但隨后的多項(xiàng)研究均表明，即使患者早期進(jìn)行了良好的液體復(fù)蘇，各臟器的損傷仍不可避免[2]。近年來，越來越多的證據(jù)認(rèn)為燒傷后中性粒細(xì)胞的大量活化可導(dǎo)致爆發(fā)性的炎癥反應(yīng)，是多臟器功能損傷的關(guān)鍵因素，通過阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生可保護(hù)受損臟器，但燒傷后炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制仍不明確，臨床也缺乏相應(yīng)的干預(yù)措施[1-3]。

在本實(shí)驗(yàn)中，對NHE1的抑制顯著升高了LVSP和LV+dP/dtmax值，降低了心肌酶(LDH、CK、 CK-MB)水平，提示NHE1抑制劑減輕了燒傷后心肌損傷；對NHE1的抑制還顯著降低了BUN和Cr水平，減輕了燒傷誘導(dǎo)的病理學(xué)改變，提示通過對NHE1的抑制減輕了肺臟、腎臟和腸道的損傷，這與以往學(xué)者在其他模型中得出的結(jié)論是一致的，這也提示了NHE1可能作為有效的干預(yù)靶點(diǎn)，進(jìn)而預(yù)防或治療燒傷后多臟器損傷。隨后的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，對NHE1的抑制顯著降低了促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，以及中性粒細(xì)胞活化程度(表現(xiàn)為MPO水平的降低)，提示對NHE1的抑制通過阻斷中性粒細(xì)胞活化，進(jìn)而減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)。然而，NHE1抑制劑是通過哪種機(jī)制阻斷了中性粒細(xì)胞的活化，目前報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)也未能闡明，在隨后的研究中我們將著重研究。

此外，NHE1介導(dǎo)多器官損傷的機(jī)制十分復(fù)雜。既往研究還表明，NHE1的活化可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高，激活鈉鈣交換，從而導(dǎo)致細(xì)胞胞內(nèi)鈣超載，激活凋亡通路，導(dǎo)致組織損傷[11-12]。而鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是燒傷后多個(gè)臟器損傷的重要機(jī)制之一，提示NHE1抑制劑也可能通過調(diào)控鈣離子介導(dǎo)燒傷后組織損傷。本實(shí)驗(yàn)僅明確了NHE1抑制劑對燒傷后多臟器損傷的治療作用，初步探討了其可能的炎性機(jī)制，進(jìn)一步的研究仍在進(jìn)行中。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)NHE1特異性抑制劑可以降低燒傷后促炎因子釋放，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)受損臟器。NHE1可能是介導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻笱装Y反應(yīng)綜合征及多臟器功能損傷的關(guān)鍵信號靶點(diǎn)，具有重要的研究價(jià)值。

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(本文編輯：甘輝亮)

Inhibition of Na+/H-exchanger 1 alleviates burn-induced multiple organ injury in rats

LiWenpeng,ZhaoGaoyang,YangXuekang,MaTeng

(TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

Objective Severe burns initiate inflammatory response characterized by the upregulation of proinflammatory cytokine, which contributes to multiple organ injury. Na+/H-exchanger 1 (NHE1) plays a significant role in several inflammatory processes. This study was designed to investigate the role of NHE1in burn-induced inflammation and multiple organ injury.Methods Rats were subjected to a 30% total body surface area full-thickness burn. Cariporide was used to assess the function of NHE1in burn-induced multiple organ injury by biochemical parameters, histologic changes, and inflammatory cytokine production.Results We found that NHE1expression was significantly increased after burn injury. Inhibition of NHE1by cariporide attenuated burn-induced edema and tissue injury in heart, lung, kidney, and small intestine. Cariporide also inhibited plasma levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 6 (IL-6), and myeloperoxidase activity (MPO).Conclusion These results indicate that NHE1inhibition prevents burn-induced multiple organ injury. The salutary effects afforded by NHE1inhibition, at least in part, are mediated by attenuating systemic inflammatory response.

Burns; Multiple organ injury; Na+/H-exchanger 1; Inflammation； Rats

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201463)

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科(李文鵬、趙高煬、楊薛康)；第四軍醫(yī)大學(xué)科研部(馬騰)

馬騰，電子信箱：mateng@fmmu.edu.cn

R542.2

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.01.006

2016-03-28)