高效液相色譜法測定不同品種辣椒藥材中辣椒堿的含量

鄭創欽

【摘要】 目的：探討不同品種辣椒藥材中辣椒堿的含量的測定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱選擇Hanbon Sci.& Tech.Lichrospher C18（250.0×4.6 mm，5 μm）進行分離，流動相為甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%～90%，0～45 min）梯度洗脫，檢測波長為280 nm，柱溫為28 ℃。結果：辣椒堿的線性回歸方程為：Y=11.918×106X-3.925×103（r=0.9997），辣椒堿在1.0007～4.0261 μg范圍內呈良好的線性關系，辣椒堿的平均回收率為99.93%，RSD=1.32%。結論：高效液相色譜法用于測定辣椒中辣椒堿的含量，成分分離效果好，系統穩定性高，操作簡單，同時適用于不同品種辣椒藥材中辣椒堿的含量測定，不同品種不同成熟度的辣椒中辣椒堿的含量具有差異性。

【關鍵詞】 高效液相色譜法； 不同品種； 辣椒； 辣椒堿

【Abstract】 Objective：To study the method for the determination of capsaicin in different varieties of capsicum.Method：High performance liquid chromatography was used，and the separation was carried out on a Hanbon Sci. & Tech. Lichrospher C18 （250.0×4.6 mm，5 m）.The mobile phase consisted of methanol：0.1% phosphoric acid aqueous solution （65%-90%，0-45 min） gradient elution， detection wavelength was 280 nm， and the detection wavelength was 28 ℃.Result：The linear regression equation of capsaicin was Y=11.918×106X-3.925×103（r=0.9997），and the capsaicin showed a good linear relationship in the range of 1.0007-4.0261 μg.The average recovery of capsaicin was 99.93%，and RSD=1.32%.Conclusion：High performance liquid chromatography （RP-HPLC） can be used to determine the content of capsaicin in capsicum， and it has good separation effect，high system stability and simple operation.It can be applied to the determination of capsaicin in different varieties of capsicum.The content of capsaicin in different varieties of different maturity is different.

【Key words】 High performance liquid chromatography； Different varieties； Pepper； Capsaicin

First-authors address：Qiaoli Traditional Chinese Medicine Hospital of Doumen District in Zhuhai City（Second Traditional Chinese Medicine Hospital in Zhuhai City），Zhuhai 519125，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.006

辣椒（Capsicum frutescence L）又稱辣角、辣子、秦椒、番椒，屬于茄科辣椒屬植物[1]，起源于南美洲的秘魯和中美洲的墨西哥一帶，在大約十六世紀末期辣椒傳入中國，被作為藥物的調味品使用[2]。辣椒傳入我國之后其分布地區較廣，品種多，應用范圍廣，具有一定的藥用價值[3]?！吨袊幍洹?010版（一部）將其作為新增品種進行規定，并通過了高效液相色譜法測定辣椒堿成分的含量以控制辣椒的質量。有研究表明，辣椒產生辣味的主要成分為辣椒堿，辣椒果實中的主要藥用成分也是辣椒堿，辣椒堿類化合物具有鎮痛、消炎、殺菌的作用，已經被應用于治療風濕、跌打損傷、鎮痛、糖尿病性神經痛以及銀屑病等疾病中[4-6]。本研究為了評價不同品種辣椒藥材的質量，以辣椒中的有效成分辣椒堿為指標成分，采用高效液相色譜法對不同品種辣椒藥材中的成分含量進行了測定，為辣椒藥材的應用和質量控制提供參考，同時為從植物資源中提取辣椒堿類物質提供檢測依據[7]。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 Agilent HP 1200型高效液相色譜儀器（其中包括四元泵，自動進樣器，DAD檢測系統，均屬于美國Agilent公司生產）[8]，美國梅特勒BP-211D電子分析天平（精密度為0.0001 g），KQ5400型超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司生產），DHG-9275B型電熱恒溫鼓風干燥箱（北京生物科技有限公司），SB-2200EYE型旋轉蒸發儀器（上海愛郎儀器有限公司）。

1.2 試藥 試驗中的不同辣椒藥材購于本市農科院，并經相關專家鑒定為辣椒正品，將藥材曬干、粉碎，置于干燥容器內備用[9]。對照品辣椒堿（中國藥品生物制品檢定所，批號：111666-201005），甲醇溶液，乙腈，磷酸溶液均為色譜純（北京化工科技有限公司），95%的乙醇溶液為藥用級別，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的配制 取同一批次的辣椒藥材約30 g，粉成粗粉后取12 g精密稱定后，置于500 mL的圓底燒瓶中[10]，加入藥材體積9倍量的95%乙醇溶液，搖勻后放置于60 ℃恒溫水浴鍋上減壓回流提取2.5 h后過濾，殘渣稱重后加入2倍量的95%乙醇溶液按照上述操作方式提取1次，將2次濾液合并后加入95%乙醇溶液定溶至216 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，置于容量瓶-20 ℃冰箱中，儲存，備用。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取辣椒堿對照品12.57 mg，置于25 mL的容量瓶中，加入95%的乙醇溶液定溶至刻度，搖勻后將不足的液體補充至刻度，得到0.503 mg/mL的辣椒堿對照品溶液[11]，置于-20 ℃冰箱中儲存備用。

2.3 色譜條件的選擇 采用高效液相色譜法，色譜柱選擇Hanbon Sci.& Tech.Lichrospher C18（250.0×4.6 mm，

5 μm）進行分離[12]，流動相為甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%～90%，0～45 min）梯度洗脫，檢測波長為280 nm，柱溫為28 ℃，進樣量為20 μL。分別取2.2項下的對照品溶液和2.1項下的供試品溶液各20 μL，按照上述色譜條件，分別連續進樣3次，辣椒堿和供試品樣品中相鄰色譜峰的分離度>1.5，以辣椒堿峰計算理論塔板數>4000。記錄色譜圖，見圖1～2。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取2.2項下的對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中[13]，用95%乙醇溶液稀釋并定溶至刻度后得到不同濃度的辣椒堿對照品溶液。分別吸取不同濃度的對照溶液各20 μL，按照2.3項下的色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度作為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：Y=11.918×106X-3.925×103（r=0.9997），辣椒堿在1.0007～4.0261 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度考察 取2.2項下的辣椒堿對照品溶液，按照2.3項下的色譜條件，每次進樣20 μL，連續進樣5次，記錄色譜峰面積并按照線性回歸方程計算，結果表明辣椒堿對照品平均色譜峰面積為135697，其RSD值為1.23%，表明所采用的高效液相色譜儀器精密度良好。

2.6 穩定性考察 取同一批次的供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、16、20 h內按照2.3項下的色譜條件分別進樣20 μL，結果表明辣椒堿的平均峰面積為406 289，RSD值為1.02%，表明辣椒供試品溶液在20 h內穩定性較好。

2.7 重復性試驗 取統一品種的辣椒樣品6份，按照2.1項下的供試品溶液配制方法制備成待測樣品溶液，按照2.3項下的色譜條件分別進樣20 μL，測定辣椒堿含量[14]，結果表明辣椒堿的平均含量為1.326 mg/g，RSD值為0.32%，表明高效液相檢測方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次樣品6份，精密稱定，分別精密加入已知濃度的辣椒堿對照品溶液（辣椒堿含量為0.503 mg/mL）1.0、1.0、2.0、2.0、4.0、4.0 mL，按照2.1項下的供試品溶液的制備方法配制成溶液后[15]，按照2.3項下的色譜條件分別進樣20 μL，按照線性回歸方程進行分析，辣椒堿的加樣平均回收率為99.93%，RSD值為1.32%，見表1。

2.9 樣品含量測定 取不同省份的辣椒藥材樣品，按照2.1項下的制備溶液方法制備成供試品溶液，取已知濃度含量的辣椒堿對照品溶液與供試品溶液各20 μL[16]，注入高效液相色譜儀器中按照2.3項下的色譜條件進行分析，按照線性關系方程計算不同省份辣椒樣品中辣椒堿的含量。由表2～3可以看出，不同地區和不同品種的辣椒中辣椒堿的含量具有一定的差異性。表2可知四川產的四川辣椒王中辣椒堿的含量與其他省份比較含量相對較高。由表3數據可知，辣椒籽中辣椒堿的含量明顯低于辣椒皮中辣椒堿的含量。

3 討論

辣椒堿類化合物是辣椒果實品質以及中藥材的重要指標[17]，本文通過試驗建立了高效液相色譜法測定辣椒中辣椒堿的方法，方法操作簡單，檢測結果準確，重復性好，可以作為辣椒原料的質量控制方法。

3.1 流動相的選擇 本研究中按照有關的參考文獻[18]采用了甲醇-水-磷酸溶液（75：25：0.1）作為高效液相色譜試驗的流動相條件進行梯度洗脫，色譜圖顯示，在上述流動相條件下，辣椒中的辣椒堿與其另外一種成分二氫辣椒堿的色譜峰分離狀況不好，在改變色譜條件的流速以及樣品的預處理方面進行改進后分離效果也不理想，因此對流動相進行了改進，甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%～90%，0～45 min）梯度洗脫，得到了較好的分離效果。

3.2 檢測波長的選擇 本次試驗開始前制備了已知濃度含量的辣椒堿對照品溶液和同一產地批次的辣椒中藥材，按照供試品溶液的制備方式配制成供試品溶液，采用95%的乙醇溶液作為空白對照組，置于紫外-可見分光光度計中，在波長為220～440 nm處進行波長掃描[19]，結果顯示在280 nm處對照品及供試品溶液均有最大的吸收波長，因此選擇280 nm作為試驗的檢測波長。

本次試驗方法對不同產地不同品種的辣椒藥材進行了測定，結果顯示四川產的四川辣椒王與其他產地的辣椒藥材比較，辣椒堿的含量相對較高，同時對這一產地的辣椒中辣椒籽和辣椒皮進行含量的比較，結果顯示辣椒堿在辣椒皮中的含量最高，說明辣椒堿主要存在于辣椒皮中[20]。

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（收稿日期：2016-12-29） （本文編輯：周亞杰）