溫針治療佐劑性關節炎大鼠經穴特異性及與肥大細胞的功能關系

荊翼,張迪

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溫針治療佐劑性關節炎大鼠經穴特異性及與肥大細胞的功能關系

荊翼1,張迪2

(1.復旦大學,上海 200433;2.上海市針灸機制與穴位功能重點實驗室,上海 201203)

目的 觀察溫針的鎮痛效應并探討其與穴區肥大細胞的功能關系、穴位特異性。方法 SD大鼠60只,隨機分為空白組(C)、模型組(M)、足三里溫針組(Z)、對側溫針組(O)、手針組(A)、伏兔溫針組(F)、陽陵泉溫針組(Y)、委中溫針組(W)、色甘酸鈉(Disodium cromoglycate)＋溫針組(DSCG＋Z)、生理鹽水＋溫針組(Saline＋Z)。以佐劑型關節炎大鼠為炎性反應痛模型(AA模型),在體觀察溫針足三里、陽陵泉、伏兔、委中過程中大鼠的縮爪反射潛伏期;并通過穴位組織切片染色,離體對照治療前后穴位處局部肥大細胞脫顆粒率的變化,以及穴區注射色甘酸鈉對其的影響。結果 溫針后穴區肥大細胞脫顆粒現象明顯(＜0.05),溫針鎮痛的效果要優于手針治療(＜0.05),足三里溫針組經治療后的痛閾均顯著高于伏兔溫針組、陽陵泉溫針組和委中溫針組(＜0.05),針刺引起的肥大細胞脫顆粒現象能被色甘酸鈉顯著阻斷(＜0.05)。結論 溫針佐劑性關節炎大鼠足三里穴可產生鎮痛效應,其鎮痛效果優于手針組,且穴區處的肥大細胞脫顆粒率高于手針組,使用肥大細胞膜穩定劑色甘酸鈉預處理后,溫針的鎮痛效應減弱。對于AA模型,溫針足三里穴的鎮痛效果優于陽陵泉、伏兔、委中穴。

針灸療法;溫針療法;生物效應;肥大細胞;鎮痛效應;脫顆粒;大鼠

針刺療法是一種有效的鎮痛手段,從上世紀70年代開始被國內外廣泛接受,并應用于臨床[1-2]。溫針灸是治療腰腿疼痛的常用療法,在毫針針刺后,于針尾加置艾炷,點燃后使其熱力通過針身傳至體內,始見于東漢時張仲景的《傷寒論》。臨床研究發現,溫針灸能有效治療類風濕關節炎等痹證[3-4],對膝骨關節炎引起的活動痛和關節壓痛都有顯著改善作用,并能有效降低復發率[5]。近年來,可控溫度的溫針儀常被臨床研究所采用,哈斯高娃[6]發現溫針儀治療風濕寒性膝關節痛要優于傳統療法,并具有溫度可調、副反應少等優點,王善言[7]發現溫針儀治療背肌筋膜炎能有效降低背肌筋膜炎患者的疼痛。

溫針治療的效果與針體的溫度有著密切關系,在軀體及皮膚組織中分布有感受不同溫度范圍的蛋白受體(瞬時感受器電位家族,TRP),其中TRPV1與溫度感受相關[8],可被熱刺激(＞43℃)激活[9],為闡明不同灸法產生不同的溫度熱刺激,從而產生不同的體表調節機體功能提供了生物學基礎。

為了闡明針刺作用的機制,近年來的研究已經深入到細胞分子層面,有研究表明,穴區的肥大細胞的數量明顯多于非穴區,并且有循經分布的特點[10],而針刺可引起穴區皮膚和肌肉的肥大細胞增多并使肥大細胞產生脫顆粒的變化[11-13]。顆粒中的主要物質包括P物質、組胺、5-HT、中性蛋白酶、白三烯、前列腺素、腫瘤生長因子等40多種介質,這些化學物質是穴位局部產生炎性反應的基礎,而這種炎性反應被看作針刺效應產生的始動環節之一[14]。經過近年來的臨床及實驗研究,闡釋了部分組織、細胞在針刺鎮痛中的作用,但并未完全闡明針刺鎮痛的機制。

足陽明胃經的足三里穴(ST36)常被作為類風濕關節炎的治療穴位,臨床研究顯示,電針足三里穴能降低類風濕關節炎患者外周血中致炎因子IL-1、IL-6、TNF-a水平[15-16]。足少陽膽經上的陽陵泉穴(GB34)常被作為鎮痛效應的實驗穴位,而同在足陽明胃經的伏兔穴(ST32)和足太陽膀胱經的委中穴(BL40)常被治療腰腿痛,本文從治療佐劑性關節炎的模型入手,來觀察這4個穴位的特異性。

本實驗使用溫針儀器刺激大鼠足三里、伏兔、陽陵泉、委中穴,選取溫度為TRPV1的激活溫度43℃,并用肥大細胞膜穩定劑色甘酸鈉預處理足三里穴位,通過治療急性佐劑性關節炎模型大鼠,觀察不同穴位溫針的鎮痛效應并探討其與穴區肥大細胞的功能關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD成年雄性大鼠,共60只,體重(250±20)g,由中國科學院上海市實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(滬)2007-0005。所有大鼠在同等標準環境(GB14925-2001)內飼育和使用,給予自然照明、飲水和飲食,適應實驗環境約1星期。隨機分為10組,每組6只,分別為空白組(C)、模型組(M)、足三里溫針組(Z)、對側溫針組(O)、手針組(A)、伏兔溫針組(F)、陽陵泉溫針組(Y)、委中溫針組(W)、色甘酸鈉＋溫針組(DSCG＋Z)、生理鹽水＋溫針組(Saline＋Z)。所有實驗方法經上海市針灸經絡研究中心實驗動物倫理委員會通過。其中,足三里溫針組、伏兔溫針組、陽陵泉溫針組、委中溫針組選取大鼠左側足三里穴,對側溫針組選取大鼠右側足三里穴,兩側痛閾均做檢測。

1.2 主要試劑與儀器

完全弗氏佐劑(CFA,美國Sigma);色甘酸鈉(DSCG,美國Sigma);IIT C 336 GT爪/尾痛覺測試儀(美國);中蒙蒙醫YY-1型溫針治療儀;臺灣YCT TC-117高精度K型熱電偶溫度表;美孚含銀導熱硅脂。

1.3 急性佐劑性關節炎大鼠模型制備

對模型組、足三里溫針組、對側溫針組、手針組、伏兔溫針組、陽陵泉溫針組、委中溫針組、色甘酸鈉＋溫針組、生理鹽水＋溫針組大鼠以10%水合氯醛按40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉。夾尾無體動反應后,左踝關節腔內注射濃度為1 mg/mL的完全弗氏佐劑0.05 mL[17]。造模后24 h,大鼠左后肢踝關節出現紅腫,左后肢抬高,大鼠行動遲緩,足底痛閾相較造模前降低,且其差異有統計學意義,說明關節炎模型制備成功。

1.4 治療方法

1.4.1 溫針儀治療方法

將溫針頭端均勻涂抹美孚含銀導熱硅脂,采用臺灣YCT TC-117高精度K型熱電偶溫度表測量不同檔位下的溫針頭端溫度。測量得出25 mA檔位輸出溫度為43℃,選取該檔位為溫針治療檔位。根據分組,分別選取足三里穴、伏兔穴、陽陵泉穴、委中穴為溫針穴位,參照《實驗針灸學》[18]中常用實驗動物針灸穴位附圖定位,將溫針直刺入大鼠穴位,深度約為7 mm,留針20 min。對側溫針組是將左后肢造模的大鼠進行右后肢的溫針治療,選取足三里穴,治療后檢測兩側的痛閾變化。

1.4.2 手針治療方法

根據足三里穴具有較強的鎮痛效應,選取足三里穴為手針用穴。參照《實驗針灸學》[18]中常用實驗動物針灸穴位附圖定位(位于腓骨小頭下方5 mm處),手針方法為選擇0.35 mm×25 mm毫針直刺,深度約7 mm,按照1次/s的頻率進行刺激。采用提插1 min,留針1 min,捻轉1 min,留針1 min的手法,反復交替,持續20 min。

1.4.3 穴位藥物注射

色甘酸鈉(DSCG)是肥大細胞膜穩定劑,具有抑制肥大細胞脫顆粒的作用。剃除大鼠左側后肢膝關節外下方被毛后,使用標準微升注射器在大鼠后左肢足三里穴區注射濃度為0.02 g/mL的色甘酸鈉20mL。注射時于穴位處直刺7 mm,邊注射邊回抽針體。

1.5 指標檢測

1.5.1 痛閾

各組分別于造模前、造模后24 h、治療前(造模后48 h)及治療后進行痛閾測定,痛閾單位為秒(s)。將大鼠放入輻射熱測痛儀靜置30 min后,用輻射熱測痛儀照射大鼠右后足墊部,以引起動物熱痛縮腿反應的潛伏期來判定。每隔5 min測痛1次,共測3次,取其平均值作為痛閾值。為防止燙傷,將潛伏期上限定為20 s。

1.5.2 穴區局部肥大細胞脫顆粒率

各組足三里穴區組織切片采用0.5%甲苯胺藍(toluidine blue,TB)染色,常規脫水、透明后封片。在10×40倍光鏡下對皮膚中肥大細胞進行計數。脫顆粒率=脫顆粒肥大細胞數/肥大細胞總數×100%。每只動物組織塊(體積約5 mm×5 mm×5 mm)取近針刺部位的3張切片進行肥大細胞脫顆粒率平均值計算,在此基礎上統計每組肥大細胞脫顆粒率。

1.6 統計學方法

本實驗數據用均數±標準差表示,使用SPSS16.0軟件,組間比較采用-檢驗,以＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 溫針對AA大鼠痛閾的影響

從圖1和表1進行組內比較可以看出,各組造模后24 h與造模前痛閾比較,均有顯著性差異(＜0.05),提示造模成功。足三里溫針組、對側溫針組左側(O L)、手針組、伏兔溫針組在治療后,痛閾相比治療前均有顯著性上升(＜0.05),而對側溫針組右側(O R)則無顯著性差異(＞0.05),說明足三里穴、伏兔穴溫針治療對AA大鼠模型有效,并且,對側溫針治療在不提高對側后肢痛閾的前提下,依舊能提高造模側痛閾,說明溫針鎮痛的效應是由穴位引導產生,并不是簡單的溫度傳導。

進行組間比較可以發現足三里溫針組與手針組比較,溫針治療的效果要遠好于手針治療(＜0.05),而足三里溫針組經治療后痛閾均顯著高于伏兔溫針組、陽陵泉溫針組和委中溫針組(＜0.05),說明對于大鼠佐劑性關節炎,溫針足三里穴的鎮痛效果要優于其他三穴,足三里穴具有特異性,與肥大細胞脫顆粒的結果相聯系,提示肥大細胞參與到了溫針鎮痛的效應中。

除此之外,生理鹽水＋溫針組治療前后有顯著性差異(＜0.05),而色甘酸鈉＋溫針組無顯著性差異。足三里溫針組與色甘酸鈉＋溫針組相比,治療后的痛閾有顯著性差異(＜0.05),而與生理鹽水＋溫針組則無差異(＞0.05)。且色甘酸鈉＋溫針組相比生理鹽水＋溫針組,治療后痛閾有顯著性差異(＜0.05),結合肥大細胞脫顆粒率可看出,經過色甘酸鈉的固定后,肥大細胞脫顆粒率減少,溫針對于痛閾的升高效應也有所減弱,說明肥大細胞在參與溫針鎮痛中發揮了重要的效應,肥大細胞脫顆粒的物質可提高佐劑性關節炎大鼠的痛閾。

2.2 溫針對AA大鼠肥大細胞脫顆粒的影響

從圖2、圖3、表2可以看出,模型組與空白組比較,肥大細胞脫顆粒率無統計學意義(＞0.05),足三里溫針組的肥大細胞脫顆粒率高于模型組(＜0.05),且足三里溫針組的肥大細胞脫顆粒率明顯高于手針組(＜0.05),說明溫針治療對于AA大鼠的鎮痛效果顯著優于手針治療。

色甘酸鈉＋溫針組與生理鹽水＋溫針組相比較,肥大細胞脫顆粒率有顯著差異性(＜0.05),說明溫針治療引起的肥大細胞脫顆粒現象能被色甘酸鈉顯著阻斷。

足三里溫針組與伏兔溫針組、陽陵泉溫針組、委中溫針組相比均有顯著性差異(＜0.05),提示足三里穴區處肥大細胞對溫針刺激的感受不同于其他三穴。

注:組內比較,與造模前比較1)P＜0.05;與治療前比較2)P＜0.05;組間比較,與足三里溫針組組比較3)P＜0.05;與色甘酸鈉＋溫針組比較4)P＜0.05

表1 各組大鼠的痛閾及痛閾變化率 (±s)

表1 各組大鼠的痛閾及痛閾變化率 (±s)

組別n造模前造模后治療后治療前后痛閾變化率/% 空白組614.32±0.7814.15±0.5314.15±0.53- 模型組615.06±1.079.65±0.501)9.65±0.50- 足三里溫針組614.43±0.899.15±0.481)16.09±0.812)77.39±10.95 對側溫針組左側614.69±1.018.98±0.331)15.39±1.532)73.79±20.84 對側溫針組右側614.20±0.8314.42±1.0014.70±0.923.16±6.98 手針組615.12±0.878.83±0.631)11.64±0.932)3)32.42±8.52 色甘酸鈉＋溫針組615.39±0.469.56±0.401)10.49±0.603)9.51±2.27 生理鹽水＋溫針組614.92±0.319.17±0.461)15.78±0.552)4)75.22±13.73 伏兔溫針組616.50±0.868.94±0.431)12.48±0.972)3)40.04±9.99 陽陵泉溫針組616.98±0.819.11±0.451)11.75±1.303)29.86±15.09 委中溫針組615.58±0.5310.93±0.361)13.14±1.003)21.76±9.46

注:與造模前比較1)＜0.05;與治療前比較2)＜0.05;與足三里溫針組比較3)＜0.05;與色甘酸鈉＋溫針組比較4)＜0.05

注:與模型組比較1)P＜0.05;與足三里溫針組比較2)P＜0.05;與色甘酸鈉＋溫針組比較3)P＜0.05

注:標尺表50 mm,箭頭所指為肥大細胞,在圖A、圖B、圖F中可以觀察到細胞膜光滑完整、處于穩定狀態下的肥大細胞;圖C、圖D、圖G、圖H中可見經溫針治療后,肥大細胞的細胞膜破裂,在細胞周圍還有被染色的顆粒

表2 大鼠皮膚中穴位處肥大細胞脫顆粒率 (±s)

表2 大鼠皮膚中穴位處肥大細胞脫顆粒率 (±s)

組別n肥大細胞脫顆粒率/% 空白組645.66±2.80 模型組651.82±1.70 足三里溫針組677.95±1.751) 對側溫針組669.65±0.98 手針組653.28±3.252) 色甘酸鈉＋溫針組648.36±1.93 生理鹽水＋溫針組667.05±2.893) 伏兔溫針組668.85±2.772) 陽陵泉溫針組661.68±2.412) 委中溫針組660.33±1.482)

注:與模型組比較1)＜0.05;與足三里溫針組比較2)＜0.05;與色甘酸鈉＋溫針組比較3)＜0.05

3 討論

由于足三里穴位具有較強的鎮痛效應,所以本實驗選取該穴位作為實驗穴位[19]。氣血喜溫惡寒,遇寒則滯,遇溫則行,因而當血脈瘀滯,則需以溫促通。本文結果顯示溫針足三里穴效果優于手針效果,進一步提示了溫度的提升提高了針灸對痹證鎮痛效果的影響。近年來經穴特異性的研究表明,經穴下不同的組織結構特征是決定經穴效應特異性的關鍵因素之一,本文實驗結果顯示,足三里穴對AA大鼠的鎮痛效果顯著優于同處于足陽明胃經的伏兔穴,而伏兔穴的效果又優于足少陽膽經的陽陵泉穴和足太陽膀胱經的委中穴。即同一經脈的不同腧穴、不同經脈上的不同腧穴之間在對AA大鼠鎮痛效應方面,雖均可提升大鼠的痛閾,但存在效應量上的差異,足三里穴對AA大鼠的鎮痛效應明顯優于其他三穴。提示足三里穴對AA大鼠有著獨特的鎮痛作用,與在臨床上足三里穴主治下肢痿痹的“經穴-病癥特異性”相符合。

經穴形態結構特異性是經穴特異性的基礎。嚴振國等[20]研究足三里、合谷、內關、神門等穴位的顯微結構發現,神經、血管和淋巴在不同穴位的分布不盡相同,而這些不同的結構在不同穴位中所起的作用亦各有側重。王秀云等[21]發現腧穴處的K﹢濃度相比非經穴處具有一定的特異性,腧穴處可能存在著K﹢的富集。本文中,溫針足三里穴產生的肥大細胞脫顆粒率高于伏兔穴、陽陵泉穴、委中穴,與痛閾變化的結果相結合,可提示不同穴位由于結構功能的不同、對熱刺激及熱能量的傳導不同,導致肥大細胞脫顆粒率有差異,進而在溫針鎮痛中發揮的功能存在差異性。

足三里穴位肥大細胞脫顆粒與針刺鎮痛效應關系密切,作為機體疏松結締組織內的一種常見細胞,肥大細胞和周圍的血管、神經叢、淋巴管等交織形成一個復雜體系,從而構成穴位的物質基礎[22]。肥大細胞雖然在機體中隨機分布,但他們更傾向于聚集在血管和神經周圍,它們與周圍神經末梢的廣泛部位有密切接觸,有時呈膜對膜接觸,但不形成類似突觸的關系。電鏡下測量肥大細胞與神經細胞之間的距離,約8%肥大細胞與大鼠腸黏膜上的神經細胞以膜-膜方式接觸,31%肥大細胞與神經細胞之間的包膜間隙約250 nm[23-24]。一般認為,生物體內解剖結構上的密切聯系往往提示功能上的相互作用。神經-免疫-內分泌調節網絡理論認為,免疫系統、神經系統以及內分泌系統相互之間都存在著雙向聯系,這種聯系通過化學信息分子和受體實現,肥大細胞與神經之間的聯絡是免疫系統與神經系統相互作用的基本內容之一[25]。根據這一理論,肥大細胞與神經纖維間存在的密切解剖關系是兩者之間功能聯系的結構基礎。肥大細胞合成釋放的生物活性物質可以改變神經元的活動,如類胰蛋白酶可直接激活神經元上的蛋白酶活化受體[26],腫瘤壞死因子和神經生長因子可降低神經興奮電位的閾值[27]。而神經細胞的活動也可影響肥大細胞的活動,神經系統經典遞質如肽類遞質、嘌呤類遞質、一氧化氮以及許多神經來源的細胞因子都對肥大細胞的功能有調節作用[28]。肽能神經末梢有大量念珠狀的膨體,一定條件下,貯存于膨體內的神經肽可被釋放,以調節周圍靶細胞或靶組織。神經肽SP和NPY(neuropeptide Y)可以通過受體非依賴機制促進肥大細胞脫顆粒而釋放生物活性物質[29-30]。

本研究中,足三里穴位使用肥大細胞膜穩定劑色甘酸鈉預處理后,溫針治療產生的鎮痛效應也被抑制,提示該鎮痛效應可能與溫針引起的肥大細胞脫顆粒有密切聯系。針刺引起穴位處肥大細胞脫顆粒釋放出眾多炎性遞質和細胞因子,作用于其附近的周圍神經末梢使神經系統產生痛覺調制效應。同針刺類似,一定強度的溫針亦存在鎮痛效應,同時還使肥大細胞產生脫顆粒的變化。這種鎮痛效應可能與肥大細胞的功能關系密切,但需注意的是溫針不但影響到穴區的肥大細胞,還會對穴區的其他組織細胞產生生物效應,如溫針能夠使局部組織溫度升高,血液流動加速,局部組織代謝增強;使局部組織內細胞胞膜通透性增加等。這些生物效應與肥大細胞脫顆粒釋放的生物活性物質,共同作用于周圍神經末梢而使神經系統產生痛覺調制。

對針灸療效機制的探討,本文提出溫針的鎮痛效應可能與穴區肥大細胞脫顆粒有密切關系,而對于溫針鎮痛效應的更確切機制,還有待進一步的研究。

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1,2.

1.,,200433,; 2.,201203,

Objective To investigate the analgesic effect of warm needling and explore its relationship with the function of mast cells in the acupoint area and the specificity of acupoints. Method Sixty SD rats were randomized into blank (C), model (M), warm needling Zusanli (Z), contralateral warm needling (O), manual acupuncture (A), warm needling Futu (F), warm needling Yanglingquan (Y), warm needling Weizhong (W), disodium cromoglycate + warm needling (DSCG＋Z) and saline + warm needling (Saline＋Z) groups. A rat with adjuvant arthritis was used as a model of inflammatory pain (AA model). Hindpaw withdrawal latency was measured in the rats during warm needling at Zusanli (ST36), Yanglingquan (SP9), Futu (ST32) and Weizhong (BL40). Pre-treatment and post-treatment rates of mast cell degranulation in the acupoint area were compared and the effect of acupoint area injection of disodium cromoglycate on the degranulation was observed by acupoint tissue section staining. Result Obvious degranulation of mast cells in the acupoint area appeared after warm needling (＞0.05). The analgesic effect of warm needling was better than that of manual acupuncture (＞0.05). After treatment, pain threshold was significantly higher in the warm needling Zusanli group than in the warm needling Futu, warm needling Yanglingquan and warm needling Weizhong groups (＞0.05). Acupuncture-induced mast cell degranulation could be prevented by disodium cromoglycate (＞0.05). Conclusion Warm needling at point Zusanli can produce an analgesic effect in adjuvant arthritis rats. Its analgesic effect is better than that of manual acupuncture. The rate of mast cell degranulation in the acupoint area is higher in the warm needling Zusanli group than in the manual acupuncture group. The analgesic effect of warm needling is reduced after pretreatment with disodium cromoglycate, a mast cell stabilizer. In an AA model, the analgesic effect of warm needling at point Zusanli is better than those of warm needling at points Yanglingquan, Futu and Weizhong.

Acupuncture-moxibustion therapy; Warm needling therapy; Biological effect; Mast cell; Analgesic effect; Degranulation; Rats

1005-0957(2017)02-0229-07

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.02.0229

2016-06-20

國家自然科學基金項目(81102630,81590950,81574053,81303027,81590953);國家重點基礎研究發展計劃(2012CB518502);上海市針灸機制與穴位功能重點實驗室(14DZ2260500)

荊翼(1990—),男,2013級碩士生,Email:13210290015@fudan.edu.cn

張迪(1980—),女,副教授,研究方向為生物物理及針灸機制研究,Email:dizhang@fudan.edu.cn