Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體在ADPC向AIPC轉變過程中的作用及機制

張紅，劉念，李征

(鄭州大學附屬南陽市中心醫院，河南南陽473400)

Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體在ADPC向AIPC轉變過程中的作用及機制

張紅，劉念，李征

(鄭州大學附屬南陽市中心醫院，河南南陽473400)

目的 探討Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體(AT1R)在雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)向雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)轉變過程中的作用及機制。方法 取ADPC組織26例份、AIPC組織4例份、正常前列腺組織15例份，良性前列腺增生組織15例份，采用免疫組化法檢測各組織AT1R、TGF-β蛋白表達，采用實時熒光定量PCR法檢測LNCaP、C4-2系列細胞(C4、C4-2及 C4-2B細胞株)給予0、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激(分別設為對照組及低、中、高劑量組)后AT1R、TGF-β mRNA的相對表達量。結果 正常前列腺組織、良性前列腺增生組織、ADPC組織、AIPC組織AT1R蛋白的相對表達量分別為1 337.49±229.85、3 683.55±251.51、6 408.50±318.00、7 088.17±410.22，兩兩比較P均<0.05；TGF-β蛋白的相對表達量分別為467.49±67.43、1 875.62±134.23、8 964.38±743.92、12 194.62±1 106.48，兩兩比較P均<0.01。LNCaP細胞和C4-2系列細胞中劑量、高劑量組 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相對表達量均高于同細胞對照組及同指標LNCaP細胞(P均<0.05)，其中C4-2B細胞低劑量組 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相對表達量均高于同細胞對照組及同指標LNCaP細胞(P均<0.05)。結論 AT1R表達升高可促進ADPC轉化為AIPC；其作用機制可能與增加TGF-β表達有關。

雄性激素依賴性前列腺癌；雄性激素非依賴性前列腺癌；Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體

近年來隨著生活方式改變和人口老齡化加劇，我國前列腺癌的發病率呈明顯上升趨勢[1,2]。雄激素去勢療法是目前治療前列腺癌的最有效方法[3]，但適用于雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)。研究發現，雄激素被阻斷20個月左右，絕大多數ADPC會發展為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)[4]，但其機制尚不完全清楚。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成有關[5～9]，在前列腺癌hPCPs細胞有絲分裂過程中發揮重要作用[9]。Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體(AT1R)是AngⅡ引起細胞增殖、血管生成等最重要的一類受體[8～11]。本研究探討AT1R在ADPC向AIPC轉變過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①前列腺組織：選取2013年1月～2015年12月南陽市中心醫院收治的30例前列腺癌患者手術切除標本，術后均經組織病理檢查確診?；颊吣挲g50～77(69.2±6.8)歲，其中ADPC 26例、AIPC 4例；Gleason評分8～10分7例，7分11例，6分12例；TNM分期T1期5例，T2期21例，T3～4期3例。行前列腺癌根治性切除術1例，姑息性經尿道前列腺癌電切手術2例(T3bN3M1、T4bN0M0各1例)，其余患者行前列腺癌內放射治療。同期納入15例份正常前列腺組織，15例份良性前列腺增生組織。②前列腺組織細胞：雄激素依賴低轉移性細胞株LNCaP、雄激素非依賴高轉移性C4-2系列細胞(包括C4、C4-2及C4-2B細胞株)均為本院實驗室留存。③其他：AT1R單克隆抗體、TGF-β單克隆抗體、Smad-7單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，AngⅡ(美國Sigma公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)，纈沙坦(瑞士諾華制藥有限公司)。

1.2 前列腺組織AT1R、TGF-β蛋白表達檢測 取所有前列腺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，采用免疫組化SP法檢測前列腺組織AT1R、TGF-β蛋白表達。PBS替代一抗作為陰性對照。以細胞質或細胞膜出現棕黃色或棕色顆粒為陽性表達，采用Image ProPlus7.0軟件分析圖像，每張組織切片隨機選取5個高倍鏡(×200)視野，計數陽性細胞積分光密度(IOD)值。以IOD值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 LNCaP細胞、C4-2系列細胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA表達檢測

1.3.1 細胞培養與藥物處理 將LNCaP細胞、C4-2系列細胞進行常規培養，取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，分別接種于50 mL培養瓶中，每瓶加入含10% FBS、100 U/mL青鏈霉素、1 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640基礎培養液，5% CO2培養箱培育48 h。吸棄培養液，換用不含FBS的培養液5 mL，將LNCaP細胞及C4-2系列細胞均隨機分為4組，每組6瓶。對照組加正常培養基，另外3組分別加入1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L的Ang Ⅱ(分別設為低、中、高劑量組)。各組繼續培養48 h，收集細胞。

1.3.2 AT1R mRNA、TGF-β mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。取上述各組細胞，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄得到cDNA。采用SYBR染料法進行實時熒光定量PCR，模版cDNA 0.5 μL、引物(20 mmol/L)0.5 μL、ddH2O 9 μL、SYBR Mix(2×)10 μL。采用2-ΔΔCt法計算各組AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

2 結果

2.1 各前列腺組織AT1R和TGF-β蛋白表達比較 AT1R蛋白在正常前列腺組織、良性前列腺增生組織、ADPC組織、AIPC組織中均有陽性表達，彌散分布于基質細胞和上皮細胞。正常前列腺組織、良性前列腺增生組織、ADPC組織、AIPC組織AT1R蛋白的相對表達量分別為1 337.49±229.85、3 683.55±251.51、6 408.50±318.00、7 088.17±410.22。各組織AT1R蛋白的相對表達量兩兩比較P均<0.05。TGF-β蛋白在正常前列腺組織、良性前列腺增生組織、ADPC組織、AIPC組織中均有陽性表達，彌散分布于細胞基質。正常前列腺組織、良性前列腺增生組織、ADPC組織、AIPC組織TGF-β蛋白的相對表達量分別為467.49±67.43、1 875.62±134.23、8 964.38±743.92、12 194.62±1 106.48。各組織TGF-β蛋白的相對表達量兩兩比較P均<0.01。

2.2 各前列腺細胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA表達比較 LNCaP細胞和C4-2系列細胞中劑量、高劑量組 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相對表達量均高于同細胞對照組及同指標LNCaP細胞(P均<0.05)，其中C4-2B細胞低劑量組 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相對表達量高于同細胞對照組及同指標LNCaP細胞(P均<0.05)。見表2。

表2 LNCaP細胞、C4-2系列細胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相對表達量比較

注：與同細胞對照組比較，*P<0.05；與同指標LNCaP細胞比較，#P<0.05。

3 討論

ADPC發展為AIPC的原因主要包括兩個方面[4]：一方面部分前列腺癌患者癌組織中含有少量AIPC細胞，雄激素去勢后，ADPC細胞被殺滅，AIPC細胞存活并生長；另一方面，絕大多數前列腺癌患者在雄激素去勢后，一部分未被殺死的ADPC細胞轉化為AIPC細胞[12]。但目前關于ADPC發展為AIPC的機制尚不完全清楚。有研究發現，AngⅡ與其受體AT1R結合可介導組織增生、腫瘤血管生成[6,11]，AngⅡ本身具有類生長因子的作用，通過與AT1R結合而促進細胞的分裂與增殖，且可與多種原癌基因和抑癌基因相互作用[13]。本研究結果顯示，AT1R和TGF-β蛋白在正常前列腺組織、良性前列腺增生組織和前列腺癌組織中均有陽性表達，彌散分布于基質細胞和上皮細胞胞，在前列腺癌組織中陽性表達更高，且AIPC組織AT1R和TGF-β蛋白表達明顯高于ADPC組織。提示AT1R和TGF-β可能參與ADPC向AIPC的轉變過程，且其表達變化與轉化趨勢一致。

AngⅡ參與多種病理生理進程，如間質纖維化[14]、炎癥[15,16]、腫瘤[17]等，TGF-β是AngⅡ關鍵的下游分子之一[15]。Lanz等[16]研究發現，Ang Ⅱ刺激星形膠質細胞和小膠質細胞的炎癥反應，激活血小板吸附蛋白1激酶促進TGF-β表達可能是其作用機制。Nataatmadja等[17]研究發現，AT1R可促進胸主動脈瘤進展，促進TGF-β 和Smad3表達是其作用機制。有研究發現，TGF-β大量分泌和再分布能夠促進ADPC細胞向AIPC細胞轉化[18,19]。ADPC向AIPC轉化過程是一個漸變的過程[20]。本研究采用ADPC細胞LNCaP和雄激素不同程度依賴性前列腺癌細胞C4、C4-2和C4-2B細胞模擬前列腺癌的臨床進展過程；結果顯示，中劑量組和高劑量組均可促進LNCaP細胞和C4-2細胞系列AT1R mRNA、TGF-β mRNA的表達，其中C4-2細胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA的表達明顯高于LNCaP細胞，且C4-2B細胞株對Ang Ⅱ最為敏感。

綜上所述，AT1R表達升高可促進ADPC向AIPC轉化；其作用機制可能與促進TGF-β表達有關。

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2016-04-06)