肝細(xì)胞癌患者外周血KIF1B、STAT4 mRNA水平變化及其臨床意義

樸金梅，李成成，王建萍，劉夢(mèng)，崔蓮花

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東青島266021；2莒縣人民醫(yī)院；3青島市標(biāo)準(zhǔn)化研究院；4青島市中心醫(yī)院)

肝細(xì)胞癌患者外周血KIF1B、STAT4 mRNA水平變化及其臨床意義

樸金梅1，2，李成成1，2，王建萍3，劉夢(mèng)1，4，崔蓮花1

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東青島266021；2莒縣人民醫(yī)院；3青島市標(biāo)準(zhǔn)化研究院；4青島市中心醫(yī)院)

目的 探討肝細(xì)胞癌(以下稱肝癌)患者外周血驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員1B(KIF1B)mRNA、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)mRNA水平變化及其臨床意義。方法 采用RT-PCR法檢測(cè)126例肝癌患者(肝癌組)、80例乙肝肝硬化患者(肝硬化組)、46例慢性乙肝患者(乙肝組)、100例體檢健康者(對(duì)照組)外周血KIF1B mRNA和STAT4 mRNA水平,分析肝癌組KIF1B mRNA和STAT4 mRNA水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 肝癌組外周血KIF1B mRNA水平明顯低于肝硬化組、肝炎組和對(duì)照組(P均<0.05),而外周血STAT4 mRNA水平與肝硬化組、肝炎組和對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。肝癌患者外周血KIF1B mRNA水平與CA199水平有關(guān)(P<0.05)，與其他臨床病理參數(shù)，如性別、年齡、TNM分期等均無關(guān)(P均>0.05)；而外周血STAT4 mRNA水平與患者年齡有關(guān)(P<0.05)，與其他臨床病理參數(shù)均無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 肝癌患者外周血KIF1B mRNA水平降低，STAT4 mRNA水平無明顯變化；外周血KIF1B mRNA水平對(duì)指導(dǎo)肝癌早期診斷和判斷預(yù)后具有一定意義。

肝細(xì)胞癌；驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員1B；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4

肝細(xì)胞癌(以下稱肝癌)發(fā)病較隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期，預(yù)后極差[1]。甲胎蛋白(AFP)是目前最常用的肝癌標(biāo)記物，但其敏感性、特異性并不理想，約1/3 肝癌患者血清AFP水平正常，而部分慢性肝病、肝硬化患者血清AFP水平亦可升高[2]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員1B(KIF1B)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)基因是肝癌的易感基因。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織和癌旁正常組織KIF1B mRNA和STAT4 mRNA表達(dá)差異明顯[3，4]。推測(cè)肝癌患者和非肝癌患者外周血KIF1B mRNA、STAT4 mRNA水平亦存在差異，但目前相關(guān)研究較少。在我國(guó)約80%肝癌與HBV感染有關(guān)，故本研究觀察了肝癌、乙肝肝硬化、慢性乙肝及體檢健康者外周血KIF1B mRNA和STAT4 mRNA水平變化，旨在為肝癌的早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年9月～2014年7月青島大學(xué)附屬醫(yī)院收治的肝癌患者126例(肝癌組)，男109例，女17例，年齡(56.2±10.5)歲；乙肝肝硬化患者80例(肝硬化組)，男69例、女11例，年齡(54.6±12.0)歲；慢性乙肝患者46例(乙肝組)，男40例、女6例，年齡(56.7±12.1)歲。肝癌診斷符合2010年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)肝膽腫瘤臨床實(shí)踐指南[5]，經(jīng)組織病理檢查明確診斷，患者入院前未行任何抗腫瘤治療；乙肝肝硬化、慢性乙肝診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南》，且未合并任何腫瘤。同期選擇體檢健康者100例(對(duì)照組)，男86例、女14例，年齡(55.5±10.6)歲。各組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 外周血KIF1B mRNA、STAT4 mRNA水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。所有研究對(duì)象清晨空腹采集肘靜脈血5 mL，采用TRIzol法提取外周血總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度合格。取總RNA 1 μg，按第一鏈cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中KIF1B、STAT4、GAPDH RNA序列設(shè)計(jì)引物，由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。引物序列：KIF1B上游引物：5′-CAGTGAAAGCCATCTCGGAGGA-3′，下游引物：5′-TGTAGTCTCGCAGGATGTCAGC-3′；STAT4上游引物：5′-CAGTGAAAGCCATCTCGGAGGA-3′，下游引物：5′-TGTAGTCTCGCAGGATGTCAGC-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGCAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應(yīng)體系共15 μL：Ultra SYBR Mixture 7.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，無酶水5.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對(duì)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以M(P25，P75)表示，結(jié)果比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血KIF1B mRNA、STAT4 mRNA水平比較 見表1。

表1 各組外周血KIF1B mRNA和STAT4 mRNA相對(duì)水平比較[M(P25，P75)]

注：與肝硬化組、乙肝組、對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 肝癌組外周血KIF1B mRNA、STAT4 mRNA水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。

表2 肝癌組外周血KIF1B mRNA、STAT4 mRNA水平與患者臨床參數(shù)的關(guān)系

注：*表示部分患者數(shù)據(jù)未能獲得。

3 討論

肝癌是世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例一半以上在中國(guó)。HBV感染是我國(guó)肝癌高發(fā)的主要原因[6]。由于肝癌發(fā)病較隱匿，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后極差，故早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療至關(guān)重要。AFP是目前最常用的診斷肝癌的生物標(biāo)記物，但其敏感性(36%～64%)、特異性(79%～91%)并不理想。目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的診斷、預(yù)后判斷中展現(xiàn)出較好價(jià)值[7]。但外周血腫瘤細(xì)胞數(shù)量極少，RT-PCR技術(shù)可在基因水平檢測(cè)隱匿性腫瘤細(xì)胞，其敏感性較其他方法高10～100倍。因此，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)外周血相應(yīng)腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)成為診斷肝癌早期轉(zhuǎn)移的重要方法之一。

KIF1B基因是驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員之一，屬于抑癌基因。KIFIB基因在正常成人和胎兒的心、腦、脾、肺、肝、腎和結(jié)腸等廣泛表達(dá)，尤以腦和神經(jīng)組織的表達(dá)最為豐富。近年研究發(fā)現(xiàn)，包括神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤都存在KIF1B表達(dá)缺失。Schlisio等[8]研究發(fā)現(xiàn)，KIFIB基因突變后，其mRNA表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生。Shi等[9]研究亦發(fā)現(xiàn)，KIF1B mRNA表達(dá)下調(diào)能夠增加卵巢癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，KIF1B基因rs17401966為HBV相關(guān)肝癌的易感基因。組織中KIF1B蛋白高表達(dá)與個(gè)體攜帶rs17401966的保護(hù)性等位型G顯著相關(guān)[9,10]，而攜帶rs17401966的危險(xiǎn)性等位型A的個(gè)體組織中KIF1B蛋白相對(duì)低表達(dá)。周鋼橋等[10]研究發(fā)現(xiàn)，KIF1B能顯著影響肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力；Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，KIF1B mRNA低表達(dá)或表達(dá)缺失可促進(jìn)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并影響患者預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組外周血KIF1B mRNA水平低于肝硬化組、乙肝組及對(duì)照組，表明外周血KIF1B mRNA水平降低可能增加肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤標(biāo)志物CA199與許多惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切有關(guān)[12]。在Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中，術(shù)前CA199正常者較CA199升高者5年總生存率和5年無病生存率均明顯降低[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血KIF1B mRNA水平與CA199水平有關(guān)，CA199高水平者外周血KIF1B mRNA低表達(dá)。因此認(rèn)為，外周血KIF1B mRNA水平對(duì)評(píng)價(jià)肝癌患者預(yù)后具有一定價(jià)值。

STAT4是STATs家族成員之一，是JAK/STAT4信號(hào)通路重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，在細(xì)胞免疫反應(yīng)、生長(zhǎng)分化、增殖凋亡及腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用。在大多數(shù)癌組織及腫瘤細(xì)胞中STAT4表達(dá)異常，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前關(guān)于STAT4在腫瘤組織中的表達(dá)結(jié)論并不一致[4,14～16]。Wubetu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織STAT4 mRNA表達(dá)下調(diào)者腫瘤侵襲性更強(qiáng)，患者預(yù)后更差；而辛彩霞等[15]研究顯示，非小細(xì)胞肺癌組織STAT4表達(dá)明顯高于正常肺組織。Kim等[17]經(jīng)過重復(fù)全基因組關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證，在肝癌組織中STAT4 mRNA表達(dá)下調(diào)。Jiang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)與STAT4基因rs7574865位點(diǎn)突變有關(guān)，且癌組織STAT4 mRNA表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，表明STAT4基因在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。本研究肝癌組外周血STAT4 mRNA水平雖然高于肝硬化組、乙肝組及對(duì)照組，但結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Ni等[18]研究結(jié)果相似。其原因可能與影響外周血STAT4 mRNA水平的因素較多、樣本量較少及研究對(duì)象不一致等有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血STAT4 mRNA水平僅與年齡有關(guān)，與其他臨床病理參數(shù)無關(guān)。提示外周血STAT4 mRNA水平能否用于肝癌診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)尚需進(jìn)一步研究。

總之，外周血KIF1B mRNA檢測(cè)對(duì)肝癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)具有一定指導(dǎo)意義。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] Bruix J, Sherman M, Llovet JM, et al. Clinical management of hepatocellular carcinoma. Conclusions of the barcelona-2000 EASL conference. European association for the study of the liver[J]. J Hepatol, 2001,35(3):421-430.

[3] Zhang H, Zhai Y, Hu Z, et al. Genome-wide association study identifies 1p36.22 as a new susceptibility locus for hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B virus carriers[J]. Nat Genet, 2010,42(9):755-758.

[4] Jiang DK, Sun J, Cao G, et al. Genetic variants in STAT4 and HLA-DQ genes confer risk of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J]. Nat Genet, 2012,45(1):72-75.

[5] 徐貴升，王育盛，王沐廷.NCCN肝膽癌臨床指引(2010.1版)[J].循證醫(yī)學(xué)，2010，10(5)：294-314.

[6] Tong HV, Bock CT, Velavan TP. Genetic insights on host and hepatitis B virus in liver diseases[J]. Mutat Res Rev Mutat Res, 2014(762):65-75.

[7] Chen Q, Ge F, Cui W, et al. Lung cancer circulating tumor cells isolated by the epcam-independent enrichment strategy correlate with cytokeratin 19-derived cyfra21-1 and pathological staging[J]. Clin Chim Acta, 2013(419):57-61.

[8] Schlisio S, Kenchappa R, Vredeveld LC, et al. The kinesin KIF1Bbeta acts downstream from EglN3 to induce apoptosis and is a potential 1p36 tumor suppressor[J]. Genes Dev, 2008,22(7):884-893.

[9] Shi T, Jiang Z, Jiang R, et al. Polymorphisms in the kinesin-like factor 1 B gene and risk of epithelial ovarian cancer in Eastern Chinese women[J]. Tumour Biol, 2015,36(9):6919-6927.

[10] 周鋼橋，賀福初，張紅星.中國(guó)人群肝癌的易感基因研究[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2011，41(10)：785-789.

[11] Yang SZ, Wang JT, Yu WW, et al. Downregulation of KIF1B mRNA in hepatocellular carcinoma tissues correlates with poor prognosis[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(27):8418-8424.

[12] Zhou G, Niu L, Chiu D, et al. Changes in the expression of serum markers CA242, CA199, CA125, CEA, TNF-α and TSGF after cryosurgery in pancreatic cancer patients[J]. Biotechnol Lett, 2012,34(7):1235-1241.

[13] 陳蕾，姜北海，邸佳柏，等.術(shù)前檢測(cè)癌胚抗原和糖鏈抗原199對(duì)結(jié)直腸癌Ⅱ～Ⅲ期患者預(yù)后的判斷價(jià)值[J].中華胃腸外科雜志，2015，18(9)：914-919.

[14] Wubetu GY, Utsunomiya T, Ishikawa D, et al. High STAT4 expression is a better prognostic indicator in patients with hepatocellular carcinoma after hepatectomy[J]. Ann Surg Oncol, 2014,21(Suppl 4):S721-S728.

[15] 辛彩霞，左自立，王鴻程，等.STAT4、STAT6與c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2011，24(4)：280-283.

[16] 聞淑娟，楊順娥，古力克孜，等.ICAM-1、STAT4在胃腺癌中的表達(dá)及意義[J].河北職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25(2)：15-18.

[17] Kim LH, Cheong HS, Namgoong S, et al. Replication of genome wide association studies on hepatocellular carcinoma susceptibility loci of STAT4 and HLA-DQ in a Korean population[J]. Infect Genet Evol, 2015(33):72-76.

[18] Ni Z, Lou W, Lee S, et al. Selective activation of members of the signal transducers and activators of transcription family in prostate carcinoma[J]. J Urol, 2002,167(4):1859-1862.

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2014JL053)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0264)；青島市科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(13-1-4-192-jch)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.025

R735.7

B

1002-266X(2017)08-0077-04

2016-09-22)