肝細胞癌患者血清miRNA-200c表達變化及其臨床意義

李濤，牛麗娟，李曼，劉文宣，楊磊，馬麗霞

(1河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，石家莊 050017；2石家莊市第三醫(yī)院)

肝細胞癌患者血清miRNA-200c表達變化及其臨床意義

李濤1，牛麗娟2，李曼1，劉文宣1，楊磊1，馬麗霞2

(1河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，石家莊 050017；2石家莊市第三醫(yī)院)

目的 探討肝細胞癌(HCC)患者血清miRNA-200c表達變化及其臨床意義。方法 選擇HCC患者60例(HCC組)、體檢健康者60例(對照組)，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測兩組血清miRNA-200c表達，并分析其表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。以血清miRNA-200c表達的均數(shù)為界值，分為miRNA-200c高表達和miRNA-200c低表達者，比較二者生存時間。結(jié)果 HCC組及對照組血清miRNA-200c相對表達量分別為0.51±0.11、0.78±0.13，兩組比較P<0.01。HCC患者miRNA-200c低表達與腫瘤直徑、TNM分期有關(guān)(P均<0.01)。miRNA-200c高表達者生存時間明顯長于miRNA-200c低表達者(χ2=8.551，P<0.01)。結(jié)論 HCC患者血清miRNA-200c低表達，其表達變化可促進HCC的發(fā)生、發(fā)展，并與患者預后有關(guān)。

肝細胞癌；微小RNA-200c；生存時間；實時熒光定量PCR技術(shù)

肝細胞癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，每年死亡人數(shù)約12萬，占全世界HCC死亡人數(shù)的40%左右[1]，其發(fā)病機制目前尚未完全清楚。微小RNA(miRNA)是一類非編碼蛋白的單鏈RNA，通過與靶mRNA結(jié)合，引起轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。有研究表明，miRNA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[2]。miRNA-200c是miRNA-200家族的重要成員，在多種腫瘤組織中異常表達，是近年臨床研究的熱點[3]。2010年1月～2015年12月，我們觀察了HCC患者血清miRNA-200c表達變化，并分析其表達變化與患者臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系。現(xiàn)分析結(jié)果并報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期石家莊市第三醫(yī)院收治的HCC患者60例(HCC組)，均為首次確診，尚未接受任何抗腫瘤治療，并排除既往有腫瘤史者。其中，男42例、女18例，年齡(58.6±10.2)歲；腫瘤直徑≤5 cm者31例，>5 cm者29例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期20例，Ⅲ、Ⅳ期40例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例；血清AFP≤200 ng/mL者19例，>200 ng/mL者41例；有HBV感染者44例，無HBV感染者16例；有肝硬化史者46例。同期選擇在該院體檢的健康志愿者60例(對照組)，男40例、女20例，年齡(57.3±9.4)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)石家莊市第三醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 血清miRNA-200c表達檢測 HCC組于確診日，對照組于體檢日，采集空腹肘靜脈血3～5 mL，常溫靜置30 min，3 000 r/min離心20 mim，取上層血清，置于無RNA酶的EP管中，-80 ℃超低溫冰箱保存。②mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄：將血清標本于37 ℃水浴中解凍，采用血清mRNA快速提取試劑盒提取總RNA，利用分光光度計檢測總RNA的純度，當OD260/OD280為1.8～2.0時，可用于后續(xù)試驗。采用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系20 μL：六堿基隨機引物1 μL(0.2 μg)，總RNA 2 μg，RNA酶抑制劑(2 U/μL) 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5×buffer 4 μL，反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL) 1 μL，余用DEPC水補足至20 μL。反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miRNA-200c：以cDNA為模板，按照實時熒光定量PCR試劑盒要求，在Rotor-GeneTM6000 PCR儀中進行實時熒光定量PCR反應。miRNA-200c上游引物：5′-GCCGATTTAATACTGCCGGGT-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，以miRNA-16為內(nèi)參。反應體系：2×buffer 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，余用DEPC水補足至20 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。每個樣本重復3次，取平均值為Ct值，計算ΔCt值，ΔCt=CtmiRNA-200c-CtmiRNA-16，采用相對定量的2-ΔCt法計算miRNA-200c的相對表達量。以HCC組血清miRNA-200c相對表達量的均數(shù)為界值，將患者分為miRNA-200c高表達者、miRNA-200c低表達者。

1.3 隨訪 采用門診和電話隨訪相結(jié)合，隨訪截至2016年6月30日，統(tǒng)計每例患者的生存時間。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miRNA-200c表達比較 HCC組血清miRNA-200c相對表達量為0.51±0.11，對照組為0.78±0.13，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=8.684，P<0.01)。

2.2 血清miRNA-200c表達與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以HCC患者血清miRNA-200c相對表達量的均數(shù)為界值，將患者分為miRNA-200c高表達者30例、miRNA-200c低表達者30例。血清miRNA-200c表達與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。

表1 血清miRNA-200c表達與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 HCC組不同miRNA-200c表達者生存情況 隨訪截至2016年6月30日，20例miRNA-200c高表達者生存15例，平均生存時間29.7個月；22例低表達者生存9例，平均生存時間21.1個月。miRNA-200c高表達者生存時間長于低表達者(χ2=8.551，P=0.003)。見圖1。

圖1 HCC組不同miRNA-200c表達者的生存曲線

3 討論

據(jù)統(tǒng)計， HCC的病死率居所有惡性腫瘤的第三位[4]。我國是HCC高發(fā)國，全球每年約50.5%的新發(fā)HCC患者出現(xiàn)在我國[5]。HCC起病隱匿，早期癥狀不明顯，但惡性程度高，病情發(fā)展迅速，大多數(shù)患者確診時已屬中晚期，治療效果較差，5年生存率僅7%左右[6，7]。因此，尋找早期診斷HCC的分子標志物對其防治具有重要意義。

miRNAs分子是一類由19～23個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過特異性的靶基因沉默調(diào)控基因表達，在腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測以及預后評估中具有重要價值，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[8，9]。miRNA-200家族包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-429和miRNA-141五個成員[10]。miRNA-200a、miRNA-200b和miRNA-429均定位于人1號染色體1p36.33區(qū)，miRNA-200c和miRNA-141定位于人12號染色體12p13.31區(qū)，這兩個區(qū)域的染色體經(jīng)常出現(xiàn)突變、缺失或易位，繼而導致腫瘤的發(fā)生[11]。miRNA-200c在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制可能與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)。EMT是在特定的生理和病理情況下上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的過程，通過EMT可改變細胞骨架、減弱基底膜與細胞間的連接、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)等細胞黏附分子表達減少、細胞極性喪失[12]。EMT是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的一個重要步驟。其中，E-cadherin表達減少被認為是EMT的重要特征之一[13]。已有研究表明，miRNA-200c可通過上調(diào)E-cadherin抑制EMT過程，從而抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，E-cadherin是參與調(diào)控腫瘤EMT的重要調(diào)節(jié)因子[14,15]。在不同腫瘤中miRNA-200c表達情況并不一致。Zhao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌患者血清miRNA-200c低表達，且其表達與腫瘤TNM分期相關(guān)。常靚等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miRNA-200c低表達，且與腫瘤組織分化程度有關(guān)。而Yu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清miRNA-200c高表達。李林霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者血清miRNA-200c表達呈現(xiàn)先高后低的動態(tài)變化。但目前鮮見HCC患者血清miRNA-200c表達變化的報道。

研究證實，與腫瘤有關(guān)的miRNA來源于腫瘤組織，并非來源于血細胞，但可在血液中穩(wěn)定存在。故血清miRNA水平可反映其在腫瘤組織中的表達情況[20]。相對于檢測腫瘤組織，特別是晚期無法獲得腫瘤組織者檢測血清標本更方便[21]。本研究HCC組血清miRNA-200c相對表達量明顯低于對照組，miRNA-200c低表達與腫瘤直徑、TNM分期有關(guān)，提示其表達下調(diào)可能參與了HCC的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移過程。miRNA-200c高表達者平均生存時間長于miRNA-200c低表達者，提示miRNA-200c表達水平可反映病情的嚴重程度并預測生存期。

綜上所述，HCC患者血清miRNA-200c表達下調(diào)，其表達變化與腫瘤直徑、TNM分期及患者預后有關(guān)，有望成為診斷HCC的分子生物標志物和特異性治療靶點。

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河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目(20150627)。

馬麗霞(E-mail： malixia518@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.021

R735.7

B

1002-266X(2017)08-0067-03

2016-08-23)