大腸癌組織PTEN表達變化及意義

嚴曉麗，蘇永志，杜夢楠，劉海麗，鄭紀寧

(1承德醫學院，河北承德067000；2承德市中心醫院)

大腸癌組織PTEN表達變化及意義

嚴曉麗1，蘇永志1，杜夢楠1，劉海麗2，鄭紀寧1

(1承德醫學院，河北承德067000；2承德市中心醫院)

目的 探討第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)在大腸癌發生、發展中的作用及其對化療耐藥的影響。方法 選擇大腸癌患者65例，取手術切除的癌組織及癌旁正常組織，采用免疫組化SP法檢測PTEN、P-糖蛋白(P-gp)表達；分析PTEN表達與患者臨床病理參數及化療耐藥的關系。結果 大腸癌組織及癌旁正常組織PTEN陽性表達率分別為52.3%(34/65)、76.9%(50/65)；P-gp陽性表達率分別為89.2%(58/65)、75.4%(49/65)。大腸癌組織PTEN、P-gp陽性表達率均高于癌旁正常組織(χ2分別為8.613、4.279，P均<0.05)。PTEN陽性表達與大腸癌患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤形態無關(P均>0.05),與組織分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。大腸癌組織中PTEN陽性表達和P-gp陽性表達呈負相關(r=-0.332，P<0.05)。結論 大腸癌組織PTEN表達降低，其表達變化與腫瘤發生、發展及化療耐藥有關。

大腸癌；第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；P-糖蛋白

近年來大腸癌的發病率逐年升高，已躍居所有惡性腫瘤的第2位[1，2]。大腸癌的治療主要采用手術+輔助性化療的綜合治療。化療耐藥是導致治療失敗的主要原因之一。P-糖蛋白(P-gp)是一種ATP能量依賴性藥物輸出泵,可將細胞內藥物泵至細胞外，從而降低細胞內藥物蓄積，導致化療效果降低[3，4]。P-gp過表達和化療耐藥密切相關。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)是一種重要的抑癌基因，在多種腫瘤組織中低表達或表達缺失[5，6]，并與腫瘤的發生、發展密切相關。但PTEN是否參與大腸癌多藥耐藥(MDR)的機制目前尚不清楚。2013年1月～2015年1月，我們觀察了大腸癌組織PTEN表達變化，并分析其表達變化與患者臨床病理特征和化療耐藥的關系。現分析結果并報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期承德醫學院附屬醫院和承德市中心醫院收治的大腸癌患者65例。所有患者行大腸癌根治術，術后組織病理檢查明確診斷，術前均未行放化療。其中，男37例、女28例，年齡35～86歲、中位年齡58.5歲；結腸癌35例，直腸癌30例；潰瘍型37例，隆起型28例；高分化25例，中低分化40例；未浸透漿膜層26例，浸透漿膜層39例；無淋巴結轉移35例，有淋巴結轉移(N1+N2)30例。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 大腸癌組織和癌旁正常組織PTEN、P-gp表達檢測 取手術切除的大腸癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)，10%中性甲醛固定，常規脫水、透明，石蠟包埋，5 μm厚連續切片。切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉緩沖液微波100 ℃ 4 min、80 ℃ 4 min抗原修復，3%過氧化氫室溫孵育8 min消除內源性過氧化物酶活性，PBS漂洗3 min×3次，山羊血清37 ℃封閉25 min，滴加一抗(PTEN鼠抗人單克隆抗體，1∶20稀釋；P-gp鼠抗人單克隆抗體，1∶50稀釋)4 ℃過夜，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗3 min×3次，滴加HRP標記的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗3 min×3次，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染8 min，鹽酸乙醇分化3 s，氨水返藍3 s，逐級脫水、透明后封片保存。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。結果判定：PTEN陽性表達定位于細胞質和細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒；P-gp陽性表達定位于細胞膜，呈黃色或棕黃色顆粒。隨機選取10個高倍鏡(×400)視野，觀察陽性細胞染色強度和陽性細胞所占比例。染色強度：無陽性染色計為0分，淺黃色計為1分，黃色計為2分，棕黃色計為3分。陽性細胞所占比例：采用MiVnt顯微圖像分析系統進行統計，陽性細胞所占比例≤5%計為1分，>5%～≤20%計為2分，>20%計為3分。以染色強度和陽性細胞所占比例綜合計分，二者乘積≥2分為陽性表達。并分析大腸癌組織PTEN陽性表達與患者臨床病理參數及P-gp陽性表達的關系。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗、連續校正法或Fisher確切概率法。相關性分析采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌組織和癌旁正常組織PTEN、P-gp陽性表達比較 大腸癌組織及癌旁正常組織PTEN陽性表達率分別為52.3%(34/65)、76.9%(50/65)，P-gp陽性表達率分別為89.2%(58/65)、75.4%(49/65)。大腸癌組織PTEN、P-gp陽性表達率均高于癌旁正常組織(χ2分別為8.613、4.279，P均<0.05)。

2.2 大腸癌組織PTEN陽性表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

2.3 大腸癌組織PTEN陽性表達與P-gp陽性表達的關系 65例大腸癌患者中，PTEN陽性表達34例，其中P-gp陽性表達27例、陰性表達7例；PTEN陰性表達31例，其中P-gp陽性表達31例，未見P-gp陰性表達。Spearman相關分析顯示，大腸癌組織PTEN陽性表達與P-gp陽性表達呈負相關(r=-0.332，P<0.05)。

表1 PTEN陽性表達與大腸癌患者臨床病理參數的關系

3 討論

腫瘤細胞MDR是導致化療失敗的主要原因。MDR即腫瘤細胞在接觸一種抗腫瘤藥物后，產生了對多種結構不同、作用機制各異的其他抗腫瘤藥物耐藥性。引起MDR的機制非常復雜，包括細胞內藥物蓄積減少、排出增多，藥物靶點發生突變，細胞修復功能增強和細胞死亡通路發生改變等。但具體機制迄今尚未完全清楚。因此，尋求判斷大腸癌化療耐藥的分子標志物、探討大腸癌化療MDR機制，對提高大腸癌患者的臨床治療效果意義重大。

MDR主要是由ATP結合盒(ABC)轉運蛋白超家族介導的胞內藥物濃度降低所致。在正常生理條件下，ABC超家族成員可依賴ATP水解酶水解供能，將細胞內毒素、生物異源物質(如藥物)和代謝產物排至細胞外，從而降低有毒物質的積累，達到自我保護的目的。同樣，ABC轉運蛋白可借助自身能量依賴的跨膜外排泵功能將細胞內的藥物泵至細胞外、降低細胞內藥物濃度，使化療藥物療效降低，甚至化療失敗。P-gp是由ABC轉運蛋白超家族成員ABCB1(MDR1)編碼的蛋白質，是最具特色的轉運蛋白成員，也是第一個被發現的人類ABC轉運蛋白。P-gp是分子量為170 kDa 的跨膜糖蛋白，依靠水解ATP釋放的能量可將細胞內藥物泵至細胞外，從而降低細胞內藥物蓄積，導致化療藥物效果下降乃至消失。經查閱PharmGKB數據庫中藥物代謝通路得知，P-gp作為細胞膜上的跨膜糖蛋白，參與多種化療藥物的代謝，如長春新堿、紫杉醇、阿霉素等，其能將胞內藥物泵至胞外的作用和腫瘤MDR密切相關。大量臨床研究發現，P-gp內源性或外源性的高表達可導致不良的臨床預后。因此，理論上任何可降低P-gp表達的物質均可使細胞內藥物聚集增加，提高胞內藥物濃度，從而有效殺傷腫瘤細胞，改善臨床化療效果；P-gp有可能成為臨床上判斷化療效果和患者預后的一個標志物。本研究大腸癌組織P-gp陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，提示大腸癌組織更能耐受化療藥物引起的細胞損傷和死亡，這為腫瘤轉移和復發提供了條件。

PTEN是一個具有脂質磷酸酶和蛋白質磷酸酶雙重活性的抑癌基因。PI3K-PIP3-Akt信號通路可影響糖代謝、細胞周期及凋亡等。PTEN可阻斷PI3K-PIP3-Akt信號通路，阻止細胞增殖和逃逸凋亡，影響腫瘤的發生和發展。Podsypanina等[7]利用PTEN敲除的小鼠模型證實，PTEN可抑制腫瘤發生、發展。本研究大腸癌組織PTEN陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，與馬穎等[8]研究結果一致，進一步證實PTEN與大腸癌的發生、發展密切相關。近年以PTEN為靶點的腫瘤治療策略在臨床上不斷應用。Podsypanina等[7]研究發現，促進野生型PTEN基因及蛋白的表達可增加傳統化療藥物對相關腫瘤的化療效果，逆轉腫瘤細胞的MDR。有研究發現，PTEN-Akt通路和多種腫瘤的化療耐藥有關，包括大腸癌[9～11]。Fang等[12]研究發現，化療可降低腫瘤組織PTEN表達，導致化療耐藥的產生。Sood等[13]研究發現，無論是在原發癌還是轉移癌中，PTEN陽性表達者整體生存率明顯高于PTEN缺失者。以上研究均說明，PTEN除了參與腫瘤的發生、發展外，還與腫瘤患者的整體預后和化療耐藥有關。通過UniHI數據庫檢索PTEN和P-gp相互作用的網絡圖可知，PTEN和P-gp確實存在著密切關系。因此，可考慮將采用外源性P-gp抑制劑轉向采用內源性的某種調控基因，進而調控P-gp表達，而PTEN可能是一個候選靶點。但PTEN與P-gp相互作用的具體機制尚未完全清楚。本研究大腸癌組織PTEN陽性表達與P-gp陽性表達呈負相關，與Qi等[14]研究結果基本一致。因此推測，PTEN參與腫瘤化療耐藥的機制除了PTEN-Akt通路外，還與P-gp的表達有關。

綜上所述，大腸癌組織PTEN表達降低，其表達變化與腫瘤發生、發展及化療耐藥有關。隨著對PTEN與腫瘤化療耐藥關系的進一步研究，PTEN聯合P-gp檢測將有可能作為判斷大腸癌病理生物學特征和預測臨床化療效果的新指標，PTEN也將會成為克服化療耐藥的一個新靶點。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] 赫捷，陳萬青.2012中國腫瘤登記年報[M].北京：軍事醫學科學出版社，2012：10.

[3] Johnson WW. P-glycoprotein-mediated efflux as a major factor in the variance of absorption and distribution of drugs: modulation of chemotherapy resistance[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2002,24(8):501-514.

[4] Sui H, Fan ZZ, Li Q. Signal transduction pathways and transcriptional mechanisms of ABCB1/Pgp-mediated multiple drug resistance in human cancer cells[J]. J Int Med Res, 2012,40(2):426-435.

[5] Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, et al. Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers[J]. Nat Genet, 1997,15(40):356-362.

[6] Wang SI, Parsons R, lttmann M. Homozygous deletion of PTEN tumor suppressor gene in a subset of prostate adenocarcinomas[J]. Clin Cancer Res, 1998,4(6):811-815.

[7] Podsypanina K， Ellenson LH， Nemes A, et al. Mutation of Pten/Mmac1 in mice causes neoplasia in multiple organ systems[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999,96(4):1563-1568.

[8] 馬穎，楊向紅，林連捷，等.PTEN和Caspase-3在大腸癌中的表達及臨床意義[J].中國醫科大學學報，2010，39(4)：290-292.

[9] Frattini M, Saletti P, Romagnani E, et al. PTEN loss of expression predicts cetuximab efficacy in metastatic colorectal cancer patients[J]. Br J Cancer, 2007,97(8):1139-1145.

[10] Berns K, Horlings HM, Hennessy BT, et al. A functional genetic approach identifies the PI3K pathway as a major determinant of trastuzumab resistance in breast cancer[J]. Cancer Cell, 2007,12(4):395-402.

[11] Wang ZH, Gao QY, Fang JY. Loss of PTEN expression as a predictor of resistance to anti-EGFR monoclonal therapy in metastatic colorectal cancer: evidence from retrospective studies[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2012,69(6):1647-1655.

[12] Fang L, Li H, Wang L, et al. MicroRNA-17-5p promotes chemotherapeutic drug resistance and tumour metastasis of colorectal cancer by repressing PTEN expression[J]. Oncotarget, 2014,5(10):2974-2987.

[13] Sood A, McClain D, Maitra R, et al. PTEN gene expression and mutations in the PIK3CA gene as predictors of clinical benefit to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapy in patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer[J]. Clin Colorectal Cancer, 2012,11(2):143-150.

[14] Qi C, Gao S, Li H, et al. The effect and mechanism of vinorelbine on cisplatin resistance of human lung cancer cell line A549/DDP[J]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 2014,17(2):148-154.

河北省高校省級重點學科建設項目(031412)；河北省高等學校科學研究計劃(ZD2014013)；2016年河北省研究生創新資助項目(275)。

鄭紀寧(E-mail： zhengjining196711@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.019

R735.3

B

1002-266X(2017)08-0061-03

2016-07-26)