TSP-1對動脈粥樣硬化大鼠血漿氧化型低密度脂蛋白的影響

丁法明，李娜，宓寶斌，畢麗麗

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

TSP-1對動脈粥樣硬化大鼠血漿氧化型低密度脂蛋白的影響

丁法明，李娜，宓寶斌，畢麗麗

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

目的 探討血小板反應(yīng)蛋白1(TSP-1)對動脈粥樣硬化(AS)大鼠血漿氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的影響。方法 采用高脂飲食法建立AS模型大鼠50只，隨機分為對照組、TSP-1重組體組、空質(zhì)粒組、TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組、TSP-1 siRNA+空質(zhì)粒組，每組10只。對照組不干預(yù)，TSP-1重組體組尾靜脈注射TSP-1重組體細(xì)胞懸液0.25 μL，空質(zhì)粒組尾靜脈注射空質(zhì)粒細(xì)胞懸液0.25 μL，TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組尾靜脈注射TSP-1 siRNA +TSP-1重組體0.25 μL，TSP-1 siRNA+空質(zhì)粒組尾靜脈注射TSP-1 siRNA +空質(zhì)粒0.25 μL。各組干預(yù)后常規(guī)飼料喂養(yǎng)至第15周，心臟取血，采用ELISA法檢測血漿ox-LDL；斷頸處死，取胸主動脈，采用免疫熒光技術(shù)檢測斑塊內(nèi)部TSP-1表達。結(jié)果 TSP-1重組體組、空質(zhì)粒組、TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組、TSP-1 siRNA+空質(zhì)粒組血漿ox-LDL水平依次降低，且均高于對照組(P均<0.05)。TSP-1重組體組TSP-1表達最高，明顯高于對照組(P<0.05)；空質(zhì)粒組、TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組、TSP-1 siRNA+空質(zhì)粒組TSP-1表達依次降低，且均低于對照組(P均<0.05)。相關(guān)分析顯示，TSP-1表達與血漿ox-LDL水平呈正相關(guān)(r=0.417，P<0.05)。結(jié)論 TSP-1可促進AS大鼠血漿ox-LDL水平升高，對AS的發(fā)生、發(fā)展起促進作用。

動脈粥樣硬化；氧化型低密度脂蛋白；血小板反應(yīng)蛋白1；大鼠

動脈粥樣硬化(AS)是心血管系統(tǒng)最常見的疾病之一，也是危害人類健康的常見疾病。普遍認(rèn)為，AS是多種因素共同作用引起的，如高血壓、高血脂、大量吸煙、糖尿病等，但其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明[1，2]。LDL是AS的獨立危險因素之一，尤其是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，在泡沫細(xì)胞形成和斑塊穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。血小板反應(yīng)蛋白1(TSP-1)作為主要的內(nèi)源性血管新生抑制因子，在氧化應(yīng)激、缺血再灌注等刺激下表達升高，在機體中主要發(fā)揮促氧化、促凋亡等作用[3]。但目前關(guān)于TSP-1在AS發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其對ox-LDL的影響報道較少。為此，我們于2014年12月～2016年12月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠55只，3月齡，體質(zhì)量(180.2±10.5)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物合格證號P00102016。所有大鼠飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境保持干燥通風(fēng)，環(huán)境溫度為18～28 ℃，相對濕度40%～60%，每日定時日光燈照射不少于10 h。TSP-1重組體、TSP-1 siRNA病毒載體，由本實驗室前期構(gòu)建。主要儀器：Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；臺式冷凍離心機、熒光定量PCR儀，美國Thermo公司；蛋白核酸定量儀，德國Eppendorf公司；凝膠成像及分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。主要試劑：核酸提取試劑盒(RP1202)，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR047A)及限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ、Bam HI，大連寶生物工程有限公司；熒光定量PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶，北京天根生化科技有限公司。

1.2 模型制備及分組處理 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后予高脂飼料喂養(yǎng)4周，隨機選取5只處死，迅速剝離主動脈，常規(guī)制備切片，HE染色，顯微鏡下觀察，均可見心肌纖維排列紊亂，肌纖維腫脹，較多炎性細(xì)胞浸潤，心肌間質(zhì)水腫，心肌細(xì)胞間可見脂質(zhì)浸潤，部分區(qū)域可見局灶性壞死，細(xì)胞核萎縮，即AS模型制備成功[4]。高脂飼料配置：在正常飼料的基礎(chǔ)上添加0.2%甲基硫氧嘧啶、0.5%膽酸、1.5%膽固醇和15.0%脂肪。隨機將50只成模大鼠分為對照組、TSP-1重組體組、空質(zhì)粒組、TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組、TSP-1 siRNA+空質(zhì)粒組，每組10只。對照組不干預(yù)，TSP-1重組體組尾靜脈注射TSP-1重組體細(xì)胞懸液0.25 μL(細(xì)胞密度為1×107個/mL)，空質(zhì)粒組尾靜脈注射空質(zhì)粒細(xì)胞懸液0.25 μL(細(xì)胞密度為1×107個/mL)，TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組尾靜脈注射TSP-1 siRNA +TSP-1重組體0.25 μL(細(xì)胞密度為1×107個/mL)，TSP-1 siRNA+空質(zhì)粒組尾靜脈注射TSP-1 siRNA +空質(zhì)粒0.25 μL(細(xì)胞密度為1×107個/mL)。各組干預(yù)后改常規(guī)飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)至第15周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 血漿ox-LDL水平 各組喂養(yǎng)至第15周，經(jīng)心臟取血6 mL，置于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取血漿，保存?zhèn)錂z。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿ox-LDL。

1.3.2 主動脈組織TSP-1表達 采用免疫組化熒光染色法。大鼠取血后斷頸處死，迅速開胸，小心摘取胸主動脈，10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟，3%雙氧水殺滅內(nèi)源性過氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，山羊血清封閉，室溫下放置20 min。加入一抗，37 ℃靜置1 h；PBS洗滌后加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃靜置20 min；PBS洗滌3次后，加入SABC試劑，37 ℃靜置20 min；PBS洗滌4次后，DBA顯色，蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。以β-actin作為內(nèi)參照。TSP-1染色呈藍色，分布于細(xì)胞核。隨機選擇5個有代表意義的高倍鏡(×400)視野，采用Image Pro Plus圖像分析軟件分析其灰度值。以其灰度值作為主動脈組織TSP-1的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿ox-LDL水平及主動脈組織TSP-1表達比較 見表1。

表1 各組血漿ox-LDL水平及主動脈組織TSP-1的相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與TSP-1重組體組比較，#P<0.05；與空質(zhì)粒組比較，△P<0.05；與TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組比較，▲P<0.05。

2.2 TSP-1表達與血漿ox-LDL水平的關(guān)系 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，主動脈組織TSP-1表達與血漿ox-LDL水平呈正相關(guān)(r=0.417，P<0.05)。

3 討論

AS是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，是導(dǎo)致冠心病、腦梗死及外周血管病的主要原因，同時也是威脅中老年人健康的主要病變之一[5]。AS發(fā)生、發(fā)展過程是一個慢性的炎癥過程，有許多炎性細(xì)胞因子參與細(xì)胞趨化、黏附及增殖、凋亡等過程[6]。有研究指出，AS的發(fā)生主要是由于受累的動脈血管內(nèi)膜下有脂質(zhì)、復(fù)合糖類聚集以及出血或血栓形成，繼而造成纖維組織增生、鈣化，并使動脈內(nèi)膜中層逐步增厚、鈣化，最終導(dǎo)致動脈壁增厚變硬、動脈管腔狹窄，出現(xiàn)AS病變[7，8]。但迄今為止，AS的具體發(fā)病機制尚未完全闡明，普遍認(rèn)為與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核巨噬細(xì)胞聚集、淋巴細(xì)胞浸潤等有關(guān)[9，10]。

ox-LDL是LDL被氧化后形成的一種脂蛋白顆粒，可攜帶膽固醇并積存于動脈壁；同時，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分化形成巨噬細(xì)胞，通過清道夫受體吞噬ox-LDL并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，即形成最早的動脈粥樣病變脂質(zhì)條紋[11～13]。一般情況下，血漿中LDL的來源有兩個途徑，主要是由VLDL異化代謝轉(zhuǎn)變而來，一部分是由肝臟合成后直接分泌到血液中[14～17]。有研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL中含有過氧化產(chǎn)物L(fēng)OOH及溶血卵磷脂，對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞有毒性作用，可破壞細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，改變其通透性，從而使細(xì)胞壞死、脫壁，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，并在血管壁堆積，誘導(dǎo)AS發(fā)生[18，19]。ox-LDL能促進內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等分泌IL-1、TNF-α等一系列因子，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。此外，ox-LDL還能直接被巨噬細(xì)胞吞噬，經(jīng)清道夫受體轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，通過損傷的內(nèi)膜進入動脈內(nèi)膜下聚集[20]。隨著AS病情的進展，血液中凝集素樣ox-LDL受體1水平會增高，導(dǎo)致動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性。由此可見，ox-LDL具有推動AS發(fā)生、發(fā)展的作用[21]。

TSP-1是一個分子量為450 kD的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于血小板的細(xì)胞膜上，主要存在于血小板α顆粒及細(xì)胞外基質(zhì)中，能被多種類型的細(xì)胞分泌[22]。TSP-1廣泛存在于各類哺乳動物體內(nèi)，具有一定的促氧化、促凋亡等作用，在組織細(xì)胞的氧化損傷、炎癥反應(yīng)中起促進作用，是體內(nèi)主要的內(nèi)源性血管新生抑制因子，能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并直接驅(qū)動內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡[23，24]。此外，TSP-1作為配體，可與細(xì)胞膜表面的CD47分子結(jié)合，參與多種病理反應(yīng)。如TSP-1可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡繼而抑制血管新生，并可保護血管性血友病因子免受裂解，以及介導(dǎo)血小板的黏附聚集，參與血栓形成，從而促進AS的形成。但其與ox-LDL的關(guān)系目前尚未完全明確[25～28]。

本研究結(jié)果顯示，TSP-1重組體組TSP-1表達最高，提示前期構(gòu)建的TSP-1重組體能上調(diào)TSP-1表達，TSP-1重組體構(gòu)建成功。對照組血漿ox-LDL水平明顯低于其他四組，提示單純高脂飲食與機體ox-LDL水平變化無明顯相關(guān)性；TSP-1重組體組、空質(zhì)粒組、TSP-1 siRNA+TSP-1重組體組、TSP-1 siRNA+空質(zhì)粒組血漿ox-LDL水平依次降低，說明上調(diào)TSP-1表達水平能在一定程度上影響機體血漿ox-LDL水平；相關(guān)分析亦顯示，主動脈組織TSP-1表達與血漿ox-LDL水平呈正相關(guān)關(guān)系，說明TSP-1表達能影響AS病情進展，對AS的發(fā)生、發(fā)展具有明顯的促進作用。

綜上所述，TSP-1在AS的始動環(huán)節(jié)中起促進作用，可通過抑制TSP-1表達來降低血漿ox-LDL水平起到減緩AS發(fā)展的效果。

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