糖尿病大鼠視網膜組織醛脫氫酶活性與表達量變化及其意義

田靜，廖榮豐，韓惠杰

(1安徽醫科大學第一附屬醫院，合肥230022；2淮北市人民醫院)

糖尿病大鼠視網膜組織醛脫氫酶活性與表達量變化及其意義

田靜1，2，廖榮豐1，韓惠杰2

(1安徽醫科大學第一附屬醫院，合肥230022；2淮北市人民醫院)

目的 探討醛脫氫酶(ALDH)在糖尿病視網膜病變發生、發展中的作用。方法 選擇SD大鼠40只，隨機分為模型組、對照組各20只。模型組采用腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，對照組同期腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。兩組分別于建模3天及建模8、16周檢測體質量及血糖；建模8、16周各處死10只，檢測視網膜組織ALDH活性和表達量，采用免疫組化法檢測視網膜組織bcl-2、bax表達，采用TUNEL法檢測視網膜神經細胞凋亡指數。結果 兩組體質量隨建模時間延長均明顯增加(P均<0.05)，但血糖變化不明顯；與對照組比較，模型組建模8、16周體質量明顯低于對照組同期(P均<0.05)，而血糖水平明顯高于對照組同期(P均<0.05)。與對照組比較，模型組建模8、16周ALDH活性和表達量均明顯升高(P均<0.05)；模型組建模16周ALDH活性和表達量均低于建模8周(P均<0.05)；對照組建模8、16周ALDH活性和表達量變化不明顯(P均>0.05)。模型組建模8、16周bcl-2、bax表達及視網膜神經細胞凋亡率均高于對照組同期，且建模16周明顯高于建模8周(P均<0.05)，而對照組變化不明顯(P>0.05)。結論 糖尿病大鼠視網膜組織ALDH活性與表達量升高，其活性與表達量變化可促進糖尿病大鼠視網膜神經細胞凋亡，且與凋亡嚴重程度有關。

糖尿病視網膜病變；醛脫氫酶；細胞凋亡；bcl-2；bax

糖尿病視網膜病變(DR)的發病機制尚未完全清楚，多數學者認為可能與脂質過氧化反應和細胞凋亡有關[1,2]。高血糖可導致機體代謝異常并誘發一系列的病理生理變化，產生多種氧自由基和細胞因子，進而導致眼組織細胞的功能和代謝異常，其中脂質過氧化物的產生在這一過程中發揮著重要作用[3]。醛脫氫酶(ALDH)能將有毒性的醛類氧化降解為相應的酸，進而降低其對機體細胞的毒性作用，但糖尿病眼部并發癥的發生是否與ALDH活性變化有關尚不完全清楚[4]。2013年3月～2016年3月，本研究觀察了糖尿病大鼠視網膜組織ALDH活性與表達量變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠40只，SPF級，7～8周齡，體質量160～180(170±6)g，購自南京中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(滬)2008-0033。所有大鼠分籠飼養，5只/籠，自由飲水、攝食，室溫22～25 ℃，相對濕度45%～46%，光照/黑暗12 h交替。Well Reader便攜式酶標儀，德國R-Biopharm公司；5417R型高速離心機，德國Eppendorf公司；Stemi DR型動物立體顯微鏡，德國Zeiss公司；超聲粉碎儀、勻漿器，寧波新芝生物股份有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)、無菌輔酶Ⅰ、磷酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)和二硫蘇糖醇(dTT)，美國Sigma公司；ALDH ELISA試劑盒，武漢優爾生科技股份有限公司；三諾GA-3血糖儀、血糖試紙，長沙三諾生物傳感股份有限公司。兔抗大鼠bcl-2、bax單克隆抗體和羊抗兔IgG抗體，南京金斯瑞生物科技有限公司。TUNEL試劑盒，上海哈靈生物科技有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 所有大鼠適應性飼養1周，隨機分為模型組、對照組，每組20只。模型組參照文獻[5,6]建立糖尿病模型，注射3天尾靜脈血糖水平為16.7～22.2 mmol/L，即造模成功。對照組僅注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。模型組給予高脂飼料、對照組給予常規飼料，連續喂養16周。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 體質量及血糖 模型組建模第3天及建模第8、16周，對照組同期，稱量體質量，斷尾取血約0.5 mL，置于抗凝處理的EP管中，12 000 r/min離心10 min，取血漿，保存備檢。采用三諾GA-3血糖儀及配套試紙檢測血糖。

1.3.2 視網膜組織上清液 ALDH活性及表達量 ①ALDH活性：模型組建模第8、16周，對照組同期，隨機處死10只，快速摘除雙側眼球，取部分視網膜組織置于Eppendorf管中，加入一定量的勻漿液(20 mmol/L磷酸鈉緩沖液、2.0 mmol/L EDTA和1.0 mmol/L dTT)，充分勻漿后超聲破碎30 s，12 000 r/min離心10 min，取上清液。取視網膜上清液25 μL置于96孔板，加入含1 mmol/L dTT的焦磷酸鈉緩沖液(100 mmol/L，pH 8.0) 175 μL、20 mmol/L無菌輔酶Ⅰ 25 μL、丙醛25 μL，室溫反應5 min，酶標儀檢測340 nm波長下吸光度(A)值。以不加蛋白的緩沖液作為空白對照。以A值表示ALDH活性。試驗重復3次，取平均值。②ALDH表達量：取部分視網膜上清液，采用ELISA法檢測ALDH。所有操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.3 視網膜組織bcl-2、bax表達 采用免疫組化法。取視網膜組織，制備石蠟切片。切片常規脫蠟，3% H2O2室溫孵育，微波抗原修復，正常山羊血清封閉，依次加入兔抗大鼠bcl-2或bax單克隆抗體(1∶50)、生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)，以PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。bcl-2、bax陽性表達均定位于細胞質，呈棕色或黃色顆粒。隨機選取5個200倍視野，計數陽性細胞及總細胞數，計算陽性表達率。陽性表達率=陽性細胞/總細胞數×100%。

1.3.4 視網膜神經細胞凋亡指數 取視網膜組織，制備石蠟切片。切片常規脫蠟、水化，按TUNEL試劑盒說明進行處理，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察。凋亡細胞的細胞核呈棕色或棕褐色。每張切片隨機取5個視野，計數陽性細胞及總細胞數，計算凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

2 結果

2.1 兩組體質量及血糖水平變化 見表1。

表1 兩組體質量及血糖水平變化±s)

注：與同組建模3天比較，*P<0.05；與同組建模8周比較，#P<0.05；與對照組同期比較，△P<0.05。

2.2 兩組視網膜組織ALDH活性及表達量比較 見表2。

表2 兩組視網膜組織ALDH活性及表達量變化±s)

注：與同組建模8周比較，*P<0.05；與對照組同期比較，#P<0.05。

2.3 兩組視網膜組織凋亡相關因子及神經細胞凋亡指數比較 見表3。

表3 兩組視網膜組織凋亡相關因子及神經細胞凋亡指數比較±s)

注：與同組建模8周比較，*P<0.05；與對照組同期比較，#P<0.05。

3 討論

DR是糖尿病最嚴重的并發癥之一，可嚴重影響患者的生活質量[7,8]。DR的臨床表現主要為視力下降、視網膜微血管瘤和點狀出血、視網膜出血斑、視網膜靜脈擴張等。目前認為，DR是糖尿病致盲的主要原因[9]，但其發病機制仍不完全清楚。大多數學者認為，DR至少包含視網膜毛細血管微動脈瘤形成、血管滲透性增加、血管閉塞、新生血管、纖維組織增生和纖維血管膜收縮等病理過程，神經細胞凋亡以及脂質過氧化物增多可能始終伴隨DR的發生和發展過程[10,11]。

有研究表明，糖尿病患者高血糖及其代謝過程可促使大量的氧自由基和脂質過氧化產物生成，如脂質衍生的醛類，其通過結構中異常活躍的碳碳不飽和鍵與體內的谷胱甘肽、賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸等蛋白質成分結合，干擾細胞信號轉導并破壞正常蛋白質與DNA合成，進而產生細胞毒性，導致眼組織病變[12]。ALDH是體內重要的抗氧化應激保護因子，通過參與多種脂肪族及芳香族醛類的物質代謝或解毒過程而減輕氧化應激反應；體內的ALDH對氧化應激導致的神經細胞及內皮細胞損傷均有較強的拮抗作用。正常眼組織可依靠ALDH降解有毒性的脂質衍生的醛類，降低醛類對機體細胞的毒性作用，保持角膜與晶狀體的透明性并能防止視網膜病變的發生[13,14]；而ALDH基因突變者不僅空腹血糖升高，視網膜病變亦隨之發生。隨著糖尿病病情發展，機體抗脂質過氧化物酶的抗氧化能力會代償性增強，ALDH的活性和表達量亦隨之升高，但隨著時間延長而逐漸降低[15,16]。本研究模型組視網膜ALDH活性和表達量在建模8周時明顯升高，建模16周時雖高于對照組，但與建模8周時比較，其活性和表達量已明顯降低，與以往研究結果基本一致。

DR不僅僅是微血管病變，還是一種神經變性性疾病，而視網膜神經細胞凋亡是其早期病理性表現之一。bcl-2是依賴線粒體凋亡通路的調控基因，主要分布于線粒體外膜、核周膜和內質網，通過抑制線粒體細胞色素C釋放而發揮抗凋亡作用；bax存在于細胞質中，受凋亡信號刺激后，使線粒體外膜通透性和細胞色素C的釋放增加，誘導細胞凋亡。二者是bcl-2家族最主要的抑制凋亡和促進凋亡蛋白[17,18]。本研究發現，與對照組比較，模型組視網膜組織bax、bcl-2表達均明顯升高，隨著建模時間延長，其表達亦隨之升高；但與bcl-2表達相比，bax表達升高更明顯，即bcl-2/bax隨著時間延長顯著降低；此外，本研究還發現，隨著建模時間延長，模型組視網膜神經細胞凋亡指數明顯升高，而對照組變化不明顯。提示糖尿病大鼠視網膜細胞存在凋亡現象，且隨著血糖水平升高，其凋亡程度逐漸加重，這可能是導致其視力下降的主要原因之一。有研究顯示，通過基因轉導使ALDH基因高表達可使細胞對體外化學毒性物質具有防護作用，還能通過抗氧化應激作用對抗細胞凋亡[19]。由此推測，糖尿病大鼠視網膜神經細胞凋亡程度增加可能與ALDH活性降低有關。

綜上所述，糖尿病大鼠視網膜組織ALDH活性與表達量升高，但隨著時間延長而降低；ALDH活性與表達量升高可促進DR的發生，且與視網膜神經細胞凋亡的嚴重程度有關。

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廖榮豐(E-mail： babytoo99@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.015

R587.2

A

1002-266X(2017)08-0050-03

2016-11-09)