姜黃素對ALD小鼠的肝保護作用及機制

董雪娜，徐力力

(1山東省立醫院，濟南250021；2濟南市傳染病醫院)

姜黃素對ALD小鼠的肝保護作用及機制

董雪娜1，徐力力2

(1山東省立醫院，濟南250021；2濟南市傳染病醫院)

目的 探討姜黃素對酒精性肝病(ALD)小鼠的肝保護作用及其可能的作用機制。方法 選擇昆明小鼠50只，隨機分為對照組、模型組和姜黃素低、中、高劑量組，每組10只。模型組及姜黃素低、中、高劑量組采用持續乙醇灌胃法建立小鼠ALD模型。同期，對照組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，姜黃素低、中、高劑量組分別給予姜黃素50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，持續4周。觀察各組體質量、肝質量、肝臟指數以及肝臟病理形態變化，檢測各組血清ALT、AST、TG及肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，Western blotting法檢測肝組織TNF-α、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達。結果 姜黃素低、中、高劑量組病理改變較模型組均有不同程度改善，姜黃素中、高劑量組肝臟指數及血清ALT、AST和TG水平均顯著低于模型組(P均<0.05)；與模型組比較，姜黃素高劑量組肝組織MDA含量顯著降低，姜黃素中、高劑量組肝組織GSH含量以及SOD、GSH-Px酶活性顯著升高(P均<0.05)；姜黃素高劑量組肝組織TNF-α、MCP-1表達明顯低于模型組(P均<0.05)。結論 姜黃素對ALD小鼠具有肝保護作用，以姜黃素高劑量組效果最顯著；其機制可能與抑制氧化應激和炎性反應有關。

酒精性肝病；姜黃素；氧化應激；炎性反應；小鼠

酒精性肝病(ALD)是酒精攝入過多導致的肝臟損傷性疾病，其發病機制涉及酒精及其代謝產物的直接肝毒性、氧化應激與脂質過氧化反應、免疫炎癥反應等多個方面[1～3]。姜黃素作為天然姜黃屬植物根莖中提取出來的一種多酚類色素，具有廣泛的生物活性和藥理作用，在抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等方面效果顯著。研究發現，姜黃素還能緩解ALD所致的肝損傷，具有護肝作用[4～6]。2014年3月～2015年1月，我們觀察了姜黃素對ALD小鼠的肝保護作用。現分析結果并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性昆明小鼠50只，SPF級，體質量18～22 g，由山東大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK(魯)20130001。所有小鼠分籠喂養，自由進食，任意飲水，溫度為18～20 ℃、濕度為50%～60%，明暗周期12 h。主要儀器：DYY-15D型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；BS-490全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；UV759S分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。主要試劑：市售56 ℃二鍋頭白酒，北京紅星股份有限公司；姜黃素，純度95%，陜西森弗生物技術有限公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；TG、ALT、AST檢測試劑盒，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；MCP-1羊多克隆抗體、TNF-α羊多克隆抗體，美國Santa Cruz公司；β-actin兔多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 動物分組及處理 所有小鼠適應性飼養1周，隨機分為對照組、模型組及姜黃素低、中、高劑量組，每組10只。姜黃素低、中、高劑量組預先給予姜黃素50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，連續7天。模型組及姜黃素低、中、高劑量組均給予56°二鍋頭白酒15 mL/(kg·d)灌胃。每天白酒灌胃前30 min，對照組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，姜黃素低、中、高劑量組給予姜黃素50、100、200 mg/(kg·d)灌胃。各組均連續灌胃4周。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 肝臟指數及肝臟病理形態 各組末次灌胃后禁食16 h、不禁水，摘除眼球采血1 mL，保存備檢。處死前稱取體質量，斷頸處死，立即取出肝臟，稱質量，計算肝臟指數。肝臟指數=肝臟質量/體質量×100%。取部分肝組織，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，5 μm厚連續切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理形態變化。

1.3.2 血清ALT、AST、TG及肝組織勻漿MDA、SOD、GSH、GSH-Px水平 所有血樣靜置2 h，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取上層血清，-20 ℃保存。采用全自動生化分析儀、速率法檢測血清ALT、AST、TG。稱取各組肝組織0.4 g，置于組織勻漿器中，加入生理鹽水4 mL，冰上研磨，制成10%組織勻漿；采用硫代巴比妥酸法檢測組織勻漿MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測組織勻漿SOD活性，可見光法檢測組織勻漿GSH含量，二硫代二硝基苯甲酸法檢測組織勻漿GSH-Px活性。所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 肝組織勻漿MCP-1和TNF-α水平 采用Western blotting法。稱取肝組織100 mg，置于組織勻漿器中，加入預冷的裂解液(含PMSF 1 μL)1 mL，冰上研磨，制備組織裂解液。冰浴上充分裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清。BCA法進行蛋白定量，取蛋白樣品30 μg行SDS-PAGE電泳，采用濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入MCP-1、TNF-α、β-actin多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，膠片曝光、顯影后進行灰度分析。以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組肝組織病理形態變化 對照組可見正常

肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，形態、結構正常。模型組肝小葉結構紊亂，肝細胞出現大量空泡性脂肪病變，胞質疏松，局部可見肝細胞點狀壞死和炎性細胞浸潤，說明模型制備成功。姜黃素低、中、高劑量組肝組織脂肪變性、細胞腫脹壞死及炎性病變均得到不同程度改善，以姜黃素高劑量組效果最明顯。見插頁Ⅱ圖3。

2.2 各組體質量、肝質量和肝臟指數比較 見表1。

表1 各組體質量、肝質量和肝臟指數比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與姜黃素低劑量組比較，◆P<0.05。

2.3 各組血清ALT、AST、TG及肝組織勻漿MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平比較 見表2、3。

表2 各組血清ALT、AST、TG水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與姜黃素低劑量組比較，◆P<0.05。

表3 各組肝組織勻漿MDA、SOD、GSH、GSH-Px水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與姜黃素低劑量組比較，◆P<0.05。

2.4 各組肝組織MCP-1、TNF-α表達比較 上述結果提示，姜黃素高劑量組肝保護效果最顯著。故本研究僅比較對照組、模型組、姜黃素高劑量組肝組織MCP-1、TNF-α表達。結果見表4。

表4 各組肝組織MCP-1、TNF-α相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

酒精在肝臟中代謝會導致肝細胞內氧化還原狀態失衡，氧化應激水平升高，繼而肝細胞的腫脹壞死，肝功能失常，最終導致ALD[1～3]。肝臟指數是肝臟質量與體質量的比值。肝臟受損后，肝臟指數可發生明顯變化，能反映肝臟病變程度[7]。ALD以肝細胞微管受損和脂質代謝紊亂為主要表現，細胞腫脹、胞質疏松，可見散在或廣泛脂滴，是ALD最早和最常見的病理改變[8，9]。本研究結果發現，模型組肝臟指數明顯增高，細胞內可見典型脂肪和炎性病理改變，證實ALD模型制備成功；與模型組比較，姜黃素各劑量組肝臟指數升高和細胞腫脹程度明顯緩解，尤其是姜黃素高劑量組效果更明顯，說明姜黃素對ALD具有肝保護作用。

ALT和AST是評價肝細胞損傷的特異性指標，TG是肝臟脂肪合成和代謝的重要指標，臨床上一般通過ALT、AST和TG水平來判斷肝損傷程度[10]。本研究結果發現，模型組血清ALT、AST、TG水平均顯著升高，說明ALD模型制備成功，而姜黃素各劑量組能顯著緩解這一狀況，進一步說明姜黃素對ALD具有一定的肝保護作用。

SOD和GSH-Px是肝臟抗氧化的關鍵酶系，具有清除自由基和過氧化物的作用；GSH是主要的還原劑，對維持機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用；MDA是最主要的脂質過氧化產物之一，可反映體內脂質過氧化的程度和自由基的生成情況，并可間接反映自由基攻擊機體細胞的嚴重程度[2，3]。大量乙醇在氧化代謝時會迅速消耗肝內的抗氧化物質，從而無法清除過多的自由基，導致脂質過氧化產物迅速增加，肝細胞膜受損。以往研究證實，姜黃素具有很強的抗氧化作用[4～6]。本研究模型組肝組織GSH含量以及SOD、GSH-Px酶活性均顯著降低，MDA含量顯著增加，說明模型組肝臟存在明顯的氧化應激反應，這可能是誘發ALD的主要原因，與以往文獻[11，12]研究結果基本一致。與模型組比較，姜黃素各劑量組上述指標均有不同程度改善，以姜黃素高劑量組效果最顯著，表明姜黃素能保護肝細胞，改善乙醇所致肝臟的氧化應激反應，從側面說明姜黃素可能作為抗氧化劑發揮ALD的肝保護作用。

TNF-α是在炎癥刺激下由巨噬細胞、單核細胞等特定細胞產生的促炎性細胞因子，在誘發慢性炎癥、促進器官纖維化的進程中起著重要作用[12]；MCP-1屬于趨化因子家族，主要與CCR2結合，介導細胞內的信號傳導，MCP-1的異常表達與多種炎癥和器官纖維化密切相關[13，14]。Mandrekar等[15]研究發現，MCP-1和TNF-α主要生成于激活的Kuffer細胞和肝星狀細胞，在乙醇喂飼的正常小鼠肝臟中均高表達，而MCP-1敲除小鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6、KC/IL-8等促炎性細胞因子表達明顯受到抑制，說明MCP-1和TNF-α在ALD的發生中具有重要作用。本研究模型組肝組織TNF-α、MCP-1相對表達量均明顯升高，表明TNF-α、MCP-1可用于評價ALD的肝損傷；姜黃素高劑量組TNF-α、MCP-1相對表達量明顯低于模型組。說明姜黃素可能通過降低TNF-α、MCP-1表達發揮抗炎作用。

總之，姜黃素對ALD小鼠具有肝保護作用，以200 mg/(kg·d)效果最顯著；其機制可能與抗氧化和抗炎活性有關。姜黃素可能通過提高清除自由基的酶活性，抑制自由基介導的脂質過氧化反應和炎癥因子表達，減輕ALD所致的肝損傷。

[1] Gao B, Bataller R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets[J]. Gastroenterology, 2011,141(5):1572-1585.

[2] Zhu R, Wang Y, Zhang L, et al. Oxidative stress and liver disease[J]. Hepatol Res, 2012,42(8):741-749.

[3] Nagy LE. The role of innate immunity in alcoholic liver disease[J]. Alcohol Res, 2015,37(2):237-250.

[4] Xiong ZE, Dong WG, Wang BY, et al. Curcumin attenuates chronic ethanol-induced liver injury by inhibition of oxidative stress via mitogen-activated protein kinase/nuclear factor E2-related factor 2 pathway in mice[J]. Pharmacogn Mag, 2015,11(44):707-715.

[5] Rong S, Zhao Y, Bao W, et al. Curcumin prevents chronic alcohol-induced liver disease involving decreasing ROS generation and enhancing antioxidative capacity[J]. Phytomedicine, 2012,19(6):545-550.

[6] Vera-Ramirez L, Pérez-Lopez P, Varela-Lopez A, et al. Curcumin and liver disease[J]. Biofactors, 2013,39(1):88-100.

[7] 彭勃，苗明三，朱平生，等.橄欖解酒飲對大小鼠急性酒精性肝損傷脂質代謝的影響[J].河南中醫學院學報，2003，18(1)：16-17.

[8] Mathews S, Xu M, Wang H, et al. Animals models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of alcohol-induced liver disease: pathophysiology, translational relevance, and challenges[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014,306(10):G819-G823.

[9] Sid B, Verrax J, Calderon PB. Role of oxidative stress in the pathogenesis of alcohol-induced liver disease[J]. Free Radic Res, 2013,47(11):894-904.

[10] Rao KN, Virji MA, Moraca MA, et al. Role of serum markers for liver function and liver regeneration in the management of chloroform poisoning[J]. J Anal Toxicol, 1993,17(2):99-102.

[11] Ceni E, Mello T, Galli A. Pathogenesis of alcoholic liver disease: role of oxidative metabolism[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(47):17756-17772.

[12] Zelová H, Ho?ek J. TNF-α signalling and inflammation: interactions between old acquaintances[J]. Inflamm Res, 2013,62(7):641-651.

[13] Yadav A, Saini V, Arora S. MCP-1: chemoattractant with a role beyond immunity: a review[J]. Clin Chim Acta, 2010,411(21):1570-1579.

[14] 方向群，朱元鈺，胡曉玲，等.氯沙坦對大鼠肺纖維化模型的干預作用及對MCP-1和bFGF表達的影響[J].中華結核和呼吸雜志，2002，25(5)：268-272.

[15] Mandrekar P, Ambade A, Lim A, et al. An essential role for monocyte chemoattractant protein-1 in alcoholic liver injury: regulation of proinflammatory cytokines and hepatic steatosis in mice[J]. Hepatology, 2011,54(6):2185-2197.

徐力力(E-mail： xull0531@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.012

R575.5

A

1002-266X(2017)08-0041-03

2016-03-18)