BMP4對胃癌細胞遷移和侵襲的影響及其作用機制

馬松林，張姮，廖宇圣，徐丹，吳杰

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，武漢430014)

BMP4對胃癌細胞遷移和侵襲的影響及其作用機制

馬松林，張姮，廖宇圣，徐丹，吳杰

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，武漢430014)

目的 探討骨形態發生蛋白4(BMP4)在胃癌細胞遷移和侵襲過程中的作用及其可能機制。方法 傳代培養胃癌細胞MGC-803，隨機分為BMP4組、anti-BMP4組和對照組。BMP4組、anti-BMP4組分別加入基因重組BMP4、anti-BMP4抗體，對照組加入等量陰性血清。培養48 h，分別取三組細胞，檢測細胞遷移能力(細胞劃痕實驗)、侵襲能力(Transwell小室法)，采用qRT-PCR法、Western blotting法檢測Snail mRNA和蛋白表達。結果 BMP4組劃痕愈合率為(80.6±7.3)%，anti-BMP4組為(43.2±2.6)%，對照組為(39.9±1.7)%；BMP4組侵襲細胞數為(83.2±5.3)個，anti-BMP4組為(49.7±3.1)個，對照組為(46.9±4.6)個；BMP4組劃痕愈合率、侵襲細胞數均明顯高于anti-BMP4組和對照組(P均<0.05)，而anti-BMP4組和對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。BMP4組Snail mRNA的相對表達量為4.3±0.20，anti-BMP4組為1.4±0.23，對照組為1.0±0.17；BMP4組Snail蛋白的相對表達量為5.3±0.59，anti-BMP4組為1.9±0.29，對照組為2.1±0.17；BMP4組Snail mRNA和蛋白的相對表達量均明顯高于anti-BMP4組、對照組(P均<0.05)，而anti-BMP4組和對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論 BMP4能促進胃癌細胞的遷移及侵襲，其機制可能與上調Snail表達有關。

胃癌；骨形態發生蛋白4；細胞遷移；細胞侵襲

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，盡管通過手術、放療及化療等可在一定程度上提高胃癌的治療效果，但患者5年生存率仍低于30%，特別是轉移性胃癌患者生存時間一般不足2年[1，2]。目前對胃癌轉移的機制仍不完全清楚。骨形態發生蛋白4(BMP4)屬于轉化生長因子β(TGF-β)超家族成員之一，在腫瘤形成過程中具有重要作用[3]。BMP4可抑制膠質瘤干細胞活性[4]，還可誘導癌細胞發生上皮間質轉化(EMT)，進而促進癌細胞惡性表型[5]。但目前關于BMP4在胃癌遷移和侵襲中的作用鮮見報道。2015年1月～2016年1月，我們觀察了BMP4對胃癌細胞遷移和侵襲的影響。現分析結果并探討其可能的作用機制，以期為治療轉移性胃癌提供理論基礎和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞MGC-803，購自華中科技大

學同濟醫學院實驗動物中心。TRIzol試劑，購自美國Invitrogen公司；cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒、RR014A qRT-PCR Kits試劑盒，購自日本TaKaRa公司；BMP4及內參GAPDH引物，由華大基因生物科技有限公司合成；BMP4一抗、GAPDH一抗、羊抗鼠二抗，購自美國Abcam公司；基因重組BMP4、anti-BMP4抗體，購自美國Sigma公司；Transwell小室，購自美國Millipore公司。全自動Western blotting實驗系統，購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養及細胞處理 取胃癌細胞MGC-803約2×104個，置于含10% FBS的DMEM中，37 ℃ 5% CO2培養箱培養48 h。待細胞生長至對數生長期時，胰酶消化后傳代，將傳代后細胞置于不同培養皿中，隨機分為BMP4組、anti-BMP4組、對照組。BMP4組加入10 ng/mL基因重組BMP4 20 μL，anti-BMP4組加入10 ng/mL anti-BMP4抗體20 μL，對照組加入等量陰性血清，培養48 h。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 細胞遷移能力 采用細胞劃痕實驗。取三組細胞接種于6孔板，待細胞完全融合時，用200 μL移液器槍頭在細胞表面作“一”字劃痕。采用WimScratch在線圖像分析系統測定48 h劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕即刻面積-劃痕48 h面積)/劃痕即刻面積×100%。劃痕愈合率越高，表示細胞遷移能力越強。實驗重復3次，取平均值。

1.3.2 細胞侵襲能力 采用Transwell小室法。取三組細胞各2×104個，接種于Matirge膠包被的Transwell小室，下室為常規培養基，培養48 h，取出Transwell小室，小心擦掉上室表面細胞，甲醇固定，結晶紫染色，顯微鏡下觀察。隨機取10個200倍視野，計數侵襲細胞數。實驗重復3次，取平均值。

1.3.3 Snail mRNA和蛋白表達 ①Snail mRNA：采用qRT-PCR法。取三組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA。取各組細胞總RNA 1 μg，按cDNA反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA。引物序列：Snail上游引物：5′-AGGTTGGAGCGGTCAGC-3′，下游引物：5′-CCTTCTCTAGGCCCTGGCT-3′；GAPDH上游引物：5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′，下游引物：5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′。反應條件：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共40個循環。以內參GAPDH進行標準化，按qRT-PCR Kits試劑盒說明書要求配制反應體系并進行PCR擴增反應。采用2-ΔΔCt法計算Snail mRNA的相對表達量。②Snail蛋白：采用Western blotting法。取三組細胞，RIPA冰上裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量。取30 μL蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2～3 h，一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，0.5% PBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，0.5% PBST洗膜后，ECL發光液化學發光，凝膠成像系統顯影。采用用Quantity One 1-D分析軟件對蛋白印跡條帶進行定量。以目的蛋白測定值與GAPDH測定值的比值作為Snail蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞遷移和侵襲能力比較 見表1。

表1 各組細胞遷移和侵襲能力比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與anti-BMP4組比較，#P<0.05。

2.2 各組Snail表達比較 見表2。

表2 各組Snail mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與anti-BMP4組比較，#P<0.05。

3 討論

胃癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤[6]，全國腫瘤防治研究辦公室2012年的數據顯示，胃癌年齡標化發病率為22.06/10萬，居所有惡性腫瘤的第二位[7]。進食腌制食品、幽門螺桿菌感染等都是導致胃癌發病的重要因素。目前認為，腫瘤的發生、發展是一系列關鍵信號通路及分子變異的結果，如p53、p21、Ras、TGF-β信號通路、BMP4、EMT等；腫瘤轉移是導致患者死亡的重要原因[8]。 研究證實，EMT是腫瘤轉移起始所經歷的必須步驟，其過程涉及細胞表型的改變，由上皮細胞表型轉變為間質細胞表型，涉及到上皮標志物E-cadherin表達下調，間質標志物N-cadherin、Vimentin表達上調[9]。Snail是EMT過程中的關鍵轉錄調控因子，能下調E-cadherin表達、上調Vimentin表達，進而誘導EMT的發生，促進腫瘤侵襲、轉移和演進[10,11]。

BMP4作為TGF-β超家族成員之一，具有廣泛的生物學作用，包括促進骨與軟骨的生成、調控多種細胞的增殖與分化，在胚胎發育早期以及骨的形成過程中發揮重要作用[12,13]。近年研究發現，BMP4在腫瘤形成過程中亦具有重要作用[3]。BMP4能夠促進癌細胞發生EMT，在多種腫瘤中已有報道。如BMP4促進細胞卵巢癌、胰腺癌、舌鱗癌等細胞的EMT[14～17]。在肝癌中，BMP4還能誘導肝癌細胞分化[18]。BMP4主要通過與相應的細胞受體結合，進而通過TGF-β/Smads信號通路影響EMT，促進腫瘤的遷移和侵襲[19，20]。有研究發現，胃癌組織BMP4高表達，抑制BMP4能增加胃癌細胞對化療藥物順鉑的敏感性[21]。但BMP4對胃癌細胞遷移和侵襲的影響目前鮮見報道。

本研究發現，BMP4組劃痕愈合率明顯高于anti-BMP4組和對照組，侵襲細胞數明顯多于anti-BMP4組和對照組，表明上調BMP4表達能顯著增強胃癌細胞的遷移及侵襲能力。BMP4組Snail mRNA和蛋白的相對表達量顯著高于anti-BMP4組和對照組，表明上調BMP4表達可增加Snail表達；而Snail是調控EMT的關鍵分子，其表達增加可顯著抑制E-cadherin表達及促進Vimentin表達[10,11，22]，促進EMT過程，進而增強胃癌細胞遷移及侵襲能力。這與其在卵巢癌[23]和胰腺癌[24]中的研究結果類似。

綜上所述，BMP4能促進胃癌細胞的遷移及侵襲，其機制可能與上調Snail表達有關。阻斷BMP4的表達或抑制BMP4的功能有望成為治療轉移性胃癌的重要策略。

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吳杰(E-mail： wujiezxhospital@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.011

R735.2

A

1002-266X(2017)08-0038-03

2016-03-01)