沉默葡萄糖調節蛋白75對人肝癌細胞HCCLM3增殖和凋亡的影響

康強，鄒浩，劉立鑫，王連敏，趙松凌，張小文

(昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明650101)

沉默葡萄糖調節蛋白75對人肝癌細胞HCCLM3增殖和凋亡的影響

康強，鄒浩，劉立鑫，王連敏，趙松凌，張小文

(昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明650101)

目的 探討沉默葡萄糖調節蛋白75(GRP75)表達對人肝癌細胞HCCLM3增殖和凋亡的影響。方法 體外培養人肝癌細胞HCCLM3，隨機分為對照組、siRNA-1組、siRNA-2組，采用脂質體轉染法將siRNA導入siRNA-1組(上游序列5′-GAGACGGUUUCCAAAUGAATT-3′，下游序列5′-UUCAUUUGGAAACCGUCUCTT-3′)、siRNA-2組(上游序列5′-GCUCUAAGGCUUCCAACCUTT-3′，下游序列5′-AGGUUGGAAGCCUUAGAGCTT-3′)，對照組不予干擾序列。采用Western blotting法檢測各組GRP75表達，采用CCK-8法檢測各組轉染2、24、48、96 h細胞增殖情況，采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。結果 與對照組比較，siRNA-1組、siRNA-2組GRP75表達明顯降低(P均<0.01)，以siRNA-2組降低更明顯(P<0.05)。與對照組比較，siRNA-1組、siRNA-2組各時點細胞增殖能力均降低(P均<0.01)，且以siRNA-2組降低更明顯(P<0.01)；與對照組比較，siRNA-1組、siRNA-2組細胞凋亡率均明顯升高(P均<0.01)，且siRNA-2組升高更明顯(P<0.01)。結論 沉默GRP75表達可抑制人肝癌細胞HCCLM3增殖活性，并促進其凋亡。

肝癌；葡萄糖調節蛋白75 ；細胞增殖；細胞凋亡

肝細胞癌(HCC)惡性程度高，患者預后差，5年生存率不足9%，即使是接受肝移植患者5年生存率也只有30%左右[1～3]。葡萄糖調節蛋白75(GRP75)屬于熱休克蛋白70家族成員之一，參與線粒體生成、細胞內運輸、細胞增殖及信號傳導等生物學過程[4～6]。研究證實，GRP75在正常組織中低表達或不表達，而在多種腫瘤中表達上調[7,8]。與其他肝癌細胞株比較，肝癌HCCLM3細胞株惡性程度更高。前期研究發現，肝癌細胞HCCLM3中GRP75表達明顯上調，并與腫瘤的惡性程度密切相關。2015年7～12月，我們通過脂質體轉染法沉默人肝癌細胞HCCLM3 GRP75表達，并觀察其對人肝癌細胞HCCLM3增殖及凋亡的影響。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HCCLM3，復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所饋贈。PBS、TBST、RIPA裂解液、PVDF膜、PMSF及不含EDTA的胰酶消化液購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。DMEM培養基、BCA蛋白定量試劑盒、驢抗兔二抗、驢抗小鼠二抗、ECL發光液、CCK-8試劑和小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自上海翊圣生物科技有限公司。脂質體轉染試劑Lipofectamine2000和Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium，美國Thermo Fisher Scientific。siRNA干擾序列，由上海吉瑪生物技術有限公司合成，考慮到siRNA干擾序列可能存在脫靶效應且序列之間的特性有所差異，為提高實驗科學性，故設計、合成兩條siRNA干擾序列進行后續實驗。siRNA序列：siRNA-1：上游序列5′-GAGACGGUUUCCAAAUGAATT-3′，下游序列5′-UUCAUUUGGAAACCGUCUCTT-3′；siRNA-2：上游序列5′-GCUCUAAGGCUUCCAACCUTT-3′，下游序列5′-AGGUUGGAAGCCUUAGAGCTT-3′。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒，美國BD公司；兔抗GRP75單克隆抗體，美國Cell Signaling Techonolg；南美FBS，德國PAN公司。5200型ECL成像系統，上海天能科技有限公司； SP-2300A2型多功能酶標儀，上海閃譜生物科技有限公司；FACSCalibur型流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 細胞培養及沉默GRP75表達 取人肝癌細胞HCCLM3置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，培養基為含10% FBS和雙抗DMEM，待細胞處于對數生長期且細胞融合達80%時，經無菌PBS沖洗、胰酶消化、培養基中和、吹打、懸浮細胞等，制成細胞密度為2.5×104個/mL的細胞懸液。取部分細胞懸液接種于6孔板，每孔2 mL。隨機將細胞分為siRNA-1組、siRNA-2組及對照組。待細胞生長至對數生長期且細胞融合達50%時，siRNA-1組、siRNA-2組分別加入siRNA-1、siRNA-2序列沉默GRP75表達，對照組不予干擾序列，其余步驟相同。用Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium稀釋轉染試劑Lipofectamine2000(50∶1)，室溫放置5 min；用Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium稀釋siRNA(25∶1)，對照組以培養基替代siRNA；將稀釋的轉染試劑與稀釋的RNA混合，形成siRNA轉染混合物，室溫放置20 min。取400 μL轉染混合物加入含1 600 μL無血清的DMEM培養基中，混勻后分別置于siRNA-1組、siRNA-2組及對照組。37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中繼續培養6 h，用含10% FBS的DMEM培養基行換液處理，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況，當細胞融合達80%時收集細胞，進行后續實驗。

1.3 siRNA沉默GRP75表達效率檢測 采用Western blotting法。取各組轉染48 h細胞，RIPA裂解提取總蛋白，BCA法蛋白定量。取蛋白裂解液80 μL，加入20 μL上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白變性，-80 ℃保存；蛋白變性后每孔上樣30 μg，經5%的濃縮膠和10%的分離膠80 V恒壓電泳，350 mA電流條件下90 min轉印至PVDF膜，轉膜完成后將PVDF膜置于TBST中漂洗1 min，用10%脫脂牛奶封閉1 h，兔抗GRP75單克隆抗體(1∶1 000)和小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，分別加入驢抗兔二抗(1∶10 000)和驢抗兔二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發光液浸潤2 min，在5200型ECL成像系統中曝光顯影，保存圖像，并進行灰度分析。

1.4 沉默GRP75表達對人肝癌細胞HCCLM3增殖能力的影響 采用CCK-8法。取各組轉染48 h細胞，接種于96孔板，每孔2×103個，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。每組設3個復孔。各組分別于貼壁2、24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h，用SP-2300A2型多功能酶標儀在480 nm處測定各孔的光密度(OD)值。以OD值為縱坐標，檢測時間點為橫坐標，繪制細胞增殖曲線。

1.5 沉默GRP75表達對人肝癌細胞HCCLM3凋亡的影響 取各組轉染48 h細胞，待細胞融合達80%時，用不含EDTA的胰酶消化、中和、吹打，收集細胞于EP管中，用預冷的PBS洗滌2次，加入100 μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin-V至細胞懸液，室溫避光10 min，再加入5 μL PI染液至細胞懸液，室溫避光10 min。上機檢測時再加入400 μL結合緩沖液，在FACSCalibur型流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況，采用流式分析軟件Flow-JO分析。

2 結果

2.1 各組GRP75相對表達量比較 對照組、siRNA-1組、siRNA-2組GRP75相對表達量分別為1.81±0.12、0.33±0.02、0.18±0.02，組間兩兩比較P均<0.05。siRNA-2組轉染細胞熒光強度高于siRNA-1組。各組轉染前、轉染24 h GRP75表達效率見插頁Ⅰ圖2。

2.2 沉默GRP75表達對HCCLM3細胞增殖能力的影響 見表1。

表1 各組不同時間HCCLM3細胞增殖能力比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.01。

2.3 沉默GRP75對HCCLM3細胞凋亡的影響 對照組、siRNA-1組、siRNA-2組細胞凋亡率分別為(7.78±0.80)%、(11.18±0.89)%、(14.68±0.99)%，組間兩兩比較P均<0.01。

3 討論

GRP75是熱休克蛋白70家族成員之一，屬于分子伴侶，其分子量約為74 kDa，又名線粒體熱休克蛋白70、肽結合蛋白74，常定位于細胞質[4，9]，在正常組織中不表達或低表達，在惡性腫瘤組織中往往呈過表達；GRP75的生物學作用與其結合的蛋白密切相關，在腫瘤的發生發展、化療藥物耐藥、惡性表型以及腫瘤免疫中扮演重要角色[8，10～12]。GRP75調節增殖和凋亡的機制目前尚未完全清楚，可能與以下機制有關[4,13,14]：①GRP75和電壓依賴陰離子選擇通道結合，調節通道性能參與能量代謝、線粒體內部穩態以及調節細胞凋亡；②GRP75與p66Shc(SHC蛋白家族成員之一，位于線粒體)相互作用，可調節線粒體凋亡的信號通路，影響細胞增殖；③GRP75結合p53蛋白，可將p53“扣留”在細胞質中，從而抑制p53蛋白轉位至細胞核，抑制p53活化轉錄，促進凋亡和遺傳穩定性；④GRP75與凋亡相關蛋白p21、p27和Bcl-2家族蛋白等相互作用，調節細胞增殖和凋亡。

Starenki等[12]研究發現，甲狀腺髓樣癌細胞GRP75表達上調，沉默GRP75可影響Bcl-2家族蛋白表達變化，如誘導p53、p21、p27表達增加，并可激活MEK/ERK信號通路，最終抑制細胞增殖，誘導細胞死亡和生長停滯。Hu等[15]研究發現，敲除GRP75能明顯抑制卵巢癌細胞A2780的增殖速度，其機制可能與GRP75激活MAPK-ERK信號通路有關。本研究發現，siRNA轉染HCCLM3細胞后，能夠有效沉默GRP75表達，細胞增殖速度明顯降低，且在沉默CRP75表達效率較好的siRNA-2組中效果更加明顯。提示沉默GRP75基因能夠抑制HCCLM3的增殖能力，與相關研究[12,16]結果基本一致。

細胞異常凋亡和腫瘤惡性程度密切相關，GRP75能夠通過多種途徑調控細胞凋亡。Wadhwa等[16]研究發現，沉默GRP75能夠調控黑色素瘤細胞中凋亡相關蛋白OAG、p53、p21、p14、Bcl-2及Bcl-xl表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡，增強細胞的惡性增殖。Wang等[17]研究發現，利用墨角藻黃素下調人膀胱癌細胞T24 GRP75表達后，同樣能夠誘導細胞凋亡。Nigam等[18]研究證實，貝恩酸能解除乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231 GRP75和p53復合物的形成，促進p53向核易位后激活其轉錄功能，可誘導p53相關的凋亡信號通路。本研究發現，沉默GRP75后，HCCLM3細胞凋亡率明顯增加，且在沉默GRP75表達效率較好的siRNA-2組中效果更明顯。提示沉默GRP75表達可增加HCCLM3細胞凋亡率，與以往研究[16～18]結果基本一致。

綜上所述，siRNA沉默HCCLM3 細胞GRP75表達能夠抑制細胞增殖活性，促進其凋亡，有可能作為HCC潛在的治療靶點。

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國家自然科學基金資助項目(81260084)。

張小文(E-mail： zhangxiaowenlu@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.009

R735.7

A

1002-266X(2017)08-0032-03

2016-08-29)