外源性硫化氫對肝星狀細胞TGF-β1表達的影響

程敏，鄭勇，陳衛剛，康馨丹，張迪，徐麗紅

(1石河子大學醫學院，新疆石河子832000；2石河子大學醫學院第一附屬醫院)

·基礎研究·

外源性硫化氫對肝星狀細胞TGF-β1表達的影響

程敏1，鄭勇2，陳衛剛2，康馨丹1，張迪1，徐麗紅2

(1石河子大學醫學院，新疆石河子832000；2石河子大學醫學院第一附屬醫院)

目的 探討外源性硫化氫(H2S)對大鼠肝星狀細胞(HSC)轉化生長因子β1(TGF-β1)表達的影響。方法 體外培養大鼠HSC-T6，隨機將細胞分為5組：空白對照組和硫氫化鈉(NaHS)50、75、100、200 μmol/L組，空白對照組僅給予L-DMEM，NaHS 50、75、100、200 μmol/L組分別給予含相應濃度NaHS的L-DMEM，培養48 h。采用Western blotting法和qRT-PCR法檢測各組TGF-β1蛋白及其mRNA表達。結果 各組均可見TGF-β1表達，證實各組HSC-T6均處于活化狀態，可模擬肝纖維化狀態下的HSC。培養48 h，NaHS 50 μmol/L組TGF-β1蛋白和mRNA表達最低，NaHS 75 μmol/L組TGF-β1蛋白和mRNA表達已明顯升高，但仍低于空白對照組(P均<0.01)；NaHS 100、200 μmol/L組TGF-β1蛋白和mRNA表達明顯高于空白對照組(P均<0.01)。結論 在一定濃度范圍內外源性H2S可延緩肝纖維化的進展，其機制與抑制TGF-β1表達有關。

肝纖維化；硫化氫；肝星狀細胞；轉化生長因子β1

肝纖維化是以細胞外基質(ECM)在肝臟彌漫性過度沉積為病理特征，其形成主要是由于肝臟受到外界刺激因子損傷后，肝星狀細胞(HSC)活化，ECM過度生成，降解相對不足，導致ECM在肝內大量沉積所致[1]。肝纖維化如得不到有效逆轉，最終將演變為肝硬化。因此，肝纖維化是慢性肝損傷轉變為不可逆性肝硬化的必經之路。有研究發現，轉化生長因子β1(TGF-β1)在HSC活化到ECM過度沉積的過程中具有重要作用[2]。本課題組前期研究發現，硫化氫(H2S)作為繼NO、CO之后第3種內源性氣體信號分子，能夠延緩肝纖維化的進展[3,4]。在體內H2S以兩種形式存在，大部分以HS-形式存在并發揮生理作用，小部分以H2S氣體形式存在。硫氫化鈉(NaHS)在溶液中解離為Na+和HS-，HS-與H+結合生成H2S，從而使液體中NaHS和H2S保持動態平衡。與H2S相比，NaHS更能保證溶液中H2S濃度的穩定性和精確性，常被用于外源性H2S的供體。2016年1～6月，本研究觀察了NaHS對HSC TGF-β1表達的影響，旨在進一步明確外源性H2S的作用及其機制。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠HSC-T6，購自自廣州吉妮歐生物科技有限公司；FBS、L-DMEM，購自美國Hyclone公司；NaHS，購自美國Sigma公司；TGF-β1抗體，購自美國Abcam公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；TRIzol，購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒，購自美國Thermo公司；SYBR Gene PCR試劑盒，購自德國QIAGEN公司；異丙醇、三氯甲烷，購自上海化學試劑研究所有限公司；TGF-β1、β-actin引物自行設計，并由上海生工生物工程股份有限公司合成；Bio-Rad電泳儀、轉膜儀、凝膠成像儀，均購自美國Bio-Rad公司；核酸蛋白測定儀、SYBR Green Ⅰ實時定量PCR儀，購自美國Thermo公司；PCR擴增儀，購自日本TaKaRa公司。

1.2 細胞培養及分組處理 取HSC-T6約2×106個，接種于細胞培養皿中，用含10%FBS的L-DMEM完全培養基培養至細胞80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用1 mL完全培養基重懸細胞。將細胞懸液接種至新的培養皿中，細胞貼壁6～8 h，PBS清洗2次，去除漂浮死細胞及殘存血清，換用無任何血清添加的L-DMEM，同步化處理12 h。隨機將細胞分為空白對照組和NaHS 50、75、100、200 μmol/L組，空白對照組僅給予L-DMEM，NaHS 50、75、100、200 μmol/L組分別給予含相應濃度NaHS的L-DMEM，培養48 h。

1.3 TGF-β1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，用冰冷PBS洗滌2～3次，冰上裂解，機械勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法蛋白定量。取總蛋白10 μL，行10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(80 V 30 min，110 V 100 min)，半干法轉印至PVDF膜(23 V 50 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃ 20 r/min搖床一抗(TGF-β1、β-actin均為1∶1 000)孵育過夜。次日，1×TBST洗脫一抗5～6次，5 min/次，常溫下二抗(1∶20 000)孵育2 h，1×TBST洗脫5～6次，5 min/次，將發光試劑混勻后滴加到PVDF膜上，暗室曝光。Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像后，采用Gel-Proanalyzer軟件分析各泳道條帶灰度值。以目的蛋白與β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 TGF-β1mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。利用TRIzol法提取各組總RNA，經核酸蛋白測定儀檢測，OD260/OD280在1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整，可滿足實驗要求。采用RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。PCR擴增：TGF-β1上游引物：5′-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3′，下游引物：5′-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3′，產物片段120 bp；β-actin上游引物：5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′，產物片段163 bp；PCR反應體系20 μL，其中cDNA 3 μL、上下游引物各1 μL、2×Synthesis qPCR Master Mix混合物10 μL、DEPC水5 μL；擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火延伸30 s，共39個循環。每個樣本設3個復孔。以β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算TGF-β1mRNA的相對表達量。

2 結果

各組均可見TGF-β1表達，證實各組HSC-T6均處于活化狀態，可模擬肝纖維化狀態下的HSC。培養48 h，NaHS 50 μmol/L組TGF-β1蛋白和mRNA表達最低，NaHS 75 μmol/L組TGF-β1蛋白和mRNA表達已明顯升高，但仍低于空白對照組(P均<0.01)；NaHS 100、200 μmol/L組TGF-β1蛋白和mRNA表達明顯高于空白對照組(P均<0.01)。結果見表1。

表1 各組TGF-β1蛋白和mRNA的相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與NaHS 50 μmol/L組比較，#P<0.01；與NaHS 75 μmol/L組比較，△P<0.01；與NaHS 100 μmol/L組比較，▲P<0.01。

3 討論

肝纖維化是由多種損傷因素，包括病毒、藥物、膽汁淤積、自身免疫等引起的病理過程，在TGF-β1、血小板衍生生長因子、結締組織生長因子及炎性因子等相互作用下， HSC直接或間接被激活并分泌大量ECM[5]，致使肝臟結構被破壞及肝實質被損傷。其中，TGF-β1是肝纖維化形成過程中最核心的細胞因子。TGF-β1一方面可不斷促進ECM的合成與分泌[6]，另一方面抑制ECM的降解，破壞基質的平衡狀態[7]。作為致肝纖維化最強的細胞因子，TGF-β1在體內分布以肝臟居首，且肝內TGF-β1活性明顯高于其他組織。因此，抑制肝臟TGF-β1表達，減少HSC TGF-β1生成，對延緩肝纖維化進程尤為重要。

在有關肝纖維化模型的研究中，經常用到原代或傳代HSC。原代培養的HSC通常用于研究相對靜止的HSC狀態，而傳代培養的HSC常被用來模擬肝纖維化狀態下的急性模型。在正常肝臟中，HSC比例僅占非實質細胞的5%～10%，且提取原代HSC的效率較低；同時，原代細胞的純化技術及培養條件對HSC狀態的影響較大，容易對實驗結果造成影響。因此，目前有關肝纖維化的研究多選用傳代的HSC。HSC-T6是一種永生系細胞，經過SV40病毒轉染后形成，可模擬肝纖維化狀態下的HSC，具有無限傳代的特性。故本研究選用HSC-T6進行后續實驗。

H2S是繼NO、CO之后發現的第3種具有類似生理效應的氣體分子。有研究發現，H2S具有調節細胞增殖、控制細胞周期、抗氧化應激、擴張血管等多種生物學效應[8，9]。在體內生理環境下，H2S在胱硫醚-B-合成酶、胱硫醚-C-裂解酶體系的作用下生成并發揮生理作用[10]。有研究發現，體內H2S含量隨著肝硬化程度的加重逐漸降低[11]。丁彥光等[12]研究發現，給予肝纖維化大鼠充足的外源性H2S，可清除自由基、提高抗氧化物酶活性、抑制HSC膠原合成、減少肝組織ECM沉積，抑制大鼠肝纖維化進展。Song等[13]研究發現，NaHS用于TGF-β1誘導的腎纖維化大鼠，可使腎組織α-平滑肌肌動蛋白、纖維黏連蛋白、Ⅰ型膠原表達明顯降低。自發性高血壓大鼠經NaHS處理后，心肌組織TGF-β1表達及心肌膠原明顯降低[14]。大鼠血漿中H2S濃度一般為(41±5) μmol/L[15]，本課題組前期研究發現，NaHS 200 μmol/L以下時對HSC及肝細胞凋亡無明顯誘導作用[16,17]。故本研究選取50～200 μmol/L的NaHS作用于HSC，觀察其對TGF-β1表達的影響，為NaHS在延緩肝纖維化方面的研究提供一定的理論依據。

在正常未活化的HSC中，TGF-β1表達極少，很難被檢測到，而HSC活化后可大量分泌[18]。本研究各組均可見TGF-β1表達，表明本研究所用的HSC已經活化，可模擬肝纖維化狀態下的HSC。本研究選擇50、75、100、200 μmol/L NaHS作用于HSC-T6 48 h，結果發現，NaHS 50 μmol/L時TGF-β1蛋白和mRNA表達最低， NaHS 75 μmol/L時TGF-β1蛋白和mRNA表達已明顯升高，但仍低于空白對照組；當NaHS 100、200 μmol/L時TGF-β1蛋白和mRNA表達明顯高于空白對照組。表明在一定濃度范圍內外源性H2S可抑制TGF-β1表達。Song等[13]將外源性H2S腹腔注射至單側輸尿管梗阻大鼠中，發現H2S的保護作用表現為“鐘型”量效關系，即NaHS的保護效應起于5.6 g/(kg·d)，達峰于56 g/(kg·d)，并于560 g/(kg·d)時發生逆轉。本研究與Song等[13]報道類似。其原因可能與H2S的“鐘型”量效關系有關，但其具體機制尚需進一步探討。有研究證實，NF-κB具有多向調節作用，可調控多種細胞因子的轉錄，包括促進TGF-β1基因的表達[19]。外源性H2S調節大鼠肝纖維化的過程中，可降低肝組織勻漿上清液中細胞因子TNF-α表達[20]，而TNF-α表達與NF-κB p65的表達呈正相關關系[21]。因此，NaHS可能通過抑制TNF-α、NF-κB的表達，影響TNF-α/NF-κB信號通路，進而抑制TGF-β1的表達。

綜上所述，在一定濃度范圍內外源性H2S可延緩肝纖維化的進展，其機制可能與抑制TGF-β1表達有關。

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國家自然科學基金資助項目(81170402、81360076)。

鄭勇(E-mail： zy2850@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.008

R575.2

A

1002-266X(2017)08-0029-03

2016-07-13)