肺鱗癌組織PD-L1表達變化及其與患者臨床病理參數和預后的關系

王玲玲，高穎，沈冰，昌紅

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038)

肺鱗癌組織PD-L1表達變化及其與患者臨床病理參數和預后的關系

王玲玲，高穎，沈冰，昌紅

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038)

目的 探討程序性死亡配體1(PD-L1)在肺鱗狀細胞癌(簡稱肺鱗癌)發生、發展中的作用。方法 選擇肺鱗癌組織90例份、正常肺組織15例份，采用免疫組化法檢測PD-L1表達，分析PD-L1表達與患者臨床病理參數及預后的關系,應用Cox比例風險回歸模型分析影響患者預后的危險因素。結果 肺鱗癌組織PD-L1陽性表達率為66.67%(60/90),正常肺組織均為陰性表達，二者比較P<0.01。肺鱗癌組織PD-L1陽性表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、吸煙史無關(P均>0.05)，與pTNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。PD-L1陽性表達者中位生存時間明顯低于陰性表達者(P<0.05)。Cox比例風險回歸模型分析顯示，PD-L1陽性、淋巴結轉移、pTNM分期(Ⅲ期)是影響肺鱗癌預后的獨立危險因素(P均<0.05)。結論 肺鱗癌組織PD-L1表達升高，其表達變化可促進肺鱗癌的進展和轉移；檢測PD-L1表達情況有助于判斷患者預后。

肺鱗狀細胞癌；程序性死亡配體1；臨床病理特征；預后

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，已居于癌癥相關死亡原因的首位[1]，近年來在我國發病率呈明顯上升趨勢[2]。肺鱗狀細胞癌(簡稱肺鱗癌)是肺癌的常見病理類型，其發病率僅次于肺腺癌[3]。隨著腫瘤相關分子靶點的篩選及相關信號通路的研究，針對驅動基因的靶向治療在肺腺癌中取得了一定效果，但在肺鱗癌中收效甚小。因此，尋找針對肺鱗癌有效治療的潛在靶基因及判斷肺鱗癌預后的分子標志物意義重大。程序性死亡配體1(PD-L1)是一種跨膜糖蛋白，屬于B7家族成員之一。有研究發現，PD-L1在多種惡性腫瘤組織中表達升高[4～6]。PD-L1與其受體程序性死亡分子1(PD-1)結合形成PD-1/PD-L通路，該通路可介導形成機體的免疫抑制微環境，參與腫瘤細胞的免疫逃逸[7，8]。但PD-L1在肺鱗癌組織中的表達變化及其與患者預后的關系鮮見報道。2006年1月～2015年1月，我們觀察了肺鱗癌組織PD-L1表達變化，現分析結果并探討其與患者臨床病理參數和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期我院手術切除的90例肺患者的癌組織標本，均經術后組織病理檢查明確為肺鱗癌。患者男79例、女11例，年齡(59±6)歲；腫瘤直徑>3 cm 65例，≤3 cm 25例；pTNM分期Ⅰ、Ⅱ期50例，Ⅲ期40例；有淋巴轉移53例，無淋巴結轉移37例；有吸煙史66例，無吸煙史24例。所有患者接受肺癌根治性手術，術前未行放療、化療及生物免疫治療，術后除Ⅰa期患者外，均接受4個療程的順鉑+吉西他濱輔助化療，且無其他癌癥病史。同期收集15例因咯血、外傷等肺良性疾病行肺葉切除的正常肺組織標本，患者男12例、女3例，年齡(57±8)歲。其性別、年齡與肺鱗癌患者相匹配。本研究經首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 肺組織PD-L1表達檢測 采用免疫組化SP法。取手術切除的肺鱗癌組織及正常肺組織，10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，切片常規脫蠟、水化，微波修復，封閉組織非特異性抗原；以兔抗人PD-L1多克隆抗體作為一抗，抗體稀釋至1∶100，室溫孵育60 min，再滴加即用型二抗室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，以PBS代替一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察切片，每張切片至少觀察5個高倍鏡(×400)視野，每個視野至少觀察100個細胞。PD-L1陽性染色主要定位于細胞質，呈黃至棕褐色顆粒。采用染色強度和陽性細胞百分比綜合判斷PD-L1陽性表達。染色強度評分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞計0分，陽性細胞≤10%計1分，>10%～≤25%計2分，>26%～≤50%計3分，>50%計4分。兩項得分相乘結果≥3分為陽性表達。分析PD-L1陽性表達與患者臨床病理參數的關系。

1.3 肺鱗癌組織PD-L1表達與患者預后的關系 對肺鱗癌患者術后通過門診和電話咨詢的方式進行隨訪，隨訪從患者手術當日算起，截至2016年1月1日。分析PD-L1表達與患者中位生存時間的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗。多因素生存分析采用Cox比例風險回歸模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺鱗癌組織和正常肺組織PD-L1表達比較 肺鱗癌組織PD-L1陽性表達率為66.67%(60/90)，正常肺組織無PD-L1陽性表達，二者比較差異有統計學意義﹙χ2=23.33，P<0.01﹚。

2.2 肺鱗癌組織PD-L1陽性表達與患者臨床病理參數的關系 肺鱗癌組織PD-L1陽性表達與pTNM分期、淋巴結轉移密切相關，Ⅲ期者PD-L1蛋白表達顯著高于Ⅰ、Ⅱ期者，有淋巴結轉移者顯著高于無淋巴結轉移者(P均<0.05)。PD-L1蛋白表達與性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑等均無關(P均>0.05)。見表1。

表1 肺鱗癌組織PD-L1陽性表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 肺鱗癌組織PD-L1表達與患者預后的關系 中位生存時間：PD-L1陽性表達者(60例)與陰性表達者(30例)分別為25、61個月，P<0.05；男性與女性分別為46、38個月，P>0.05；年齡<55歲者與≥55歲者分別為43、37個月，P>0.05；腫瘤直徑>3 cm者與≤3 cm者分別為41、48個月，P>0.05；pTNM分期Ⅰ、Ⅱ期者與Ⅲ期者分別為58、36個月，P<0.05；有淋巴結轉移者與無淋巴結轉移者分別為26、49個月，P<0.05；有吸煙史者與無吸煙史者分別為42、46個月，P>0.05。Kaplan-Meier生存分析顯示，pTNM分期、淋巴結轉移可能與中位生存時間有關(P均<0.05)。Cox比例風險回歸模型顯示，PD-L1(HR=9.758，95%CI為2.459～22.717)、淋巴結轉移(HR=2.251，95%CI為1.051～7.669)、pTNM分期Ⅲ期(HR=1.556，95%CI為1.060～5.923)是影響肺鱗癌患者預后的獨立危險因素(P均<0.05)。

3 討論

肺癌是當今危害人類健康最常見的惡性腫瘤之一，目前在世界范圍內，每年約有180萬新發肺癌患者，每年因肺癌造成的相關性死亡患者近160萬人，占腫瘤相關性死亡的19.4%，其發病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤之首[9]。在肺癌的常見病理類型中，肺鱗癌的發病率僅次于肺腺癌,位于肺癌所有病理類型的第二位，近年來其發病率有明顯上升趨勢[10，11]。目前，針對肺腺癌的靶向治療藥物已取得了一定進展，如EML4-ALK融合基因的抑制劑[12]、EGFR酪氨酸激酶抑制劑[13]等，但針對肺鱗癌的靶向治療研究進展緩慢，目前對進展期肺鱗癌主要依靠化療，患者預后較差，導致肺癌的總體預后依然較差，5年生存率仍不足15%。因此，尋找針對肺鱗癌治療有效的潛在靶基因及判斷肺鱗癌預后的分子標志物意義重大。

PD-1是CD28/細胞毒性T細胞相關抗原4家族成員，由位于第2號染色體的Pdcd1基因編碼，包含一個胞外IgV樣區、一個疏水跨膜區、一個胞內區。PD-L1是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于B7家族成員之一，一級結構包括290個氨基酸，亦由胞外區、疏水跨膜及尾部胞漿區組成。PD-L1蛋白廣泛表達于活化T淋巴細胞、巨噬細胞、B細胞等免疫細胞[14]，還表達于多種類型的惡性腫瘤細胞表面。有研究發現，PD-L1與其受體PD-1結合后激活PD-1/PD-L通路，可對T細胞功能產生負性調節作用，從而產生對機體的免疫抑制作用[15]，在惡性腫瘤的發生、發展中起著一定作用。已有研究報道，PD-L1在乳腺癌、膠質瘤、惡性黑色素瘤等腫瘤組織中表達升高，并參與腫瘤的免疫逃逸，繼而促進腫瘤的發展[4～6]。PD-L1表達升高，可通過增強PD-1/PD-L1信號通路，抑制腫瘤特異性T淋巴細胞的增殖及正常功能，使腫瘤細胞得以生存及快速發展。Koh等[16]研究發現，在肺腺癌組織中PD-L1的陽性表達率為59%，且其陽性表達與患者淋巴結轉移、組織分化程度及吸煙有關。但其與患者性別、年齡、吸煙史等基本特征關系的研究結果尚不一致[17，18]。本研究發現，肺鱗癌組織PD-L1陽性表達明顯高于正常肺組織；PD-L1陽性表達與患者pTNM分期、淋巴轉移有關。提示PD-L1在肺鱗癌的發生、進展過程中具有重要作用。

目前，PD-L1對惡性腫瘤患者預后影響的結果尚不一致。有研究發現，PD-L1過表達的胰腺癌、結腸癌、肝癌等侵襲性高，患者預后差[19，20]。Chen等[21]研究發現，PD-L1陽性的非小細胞肺癌患者預后差，生存期短；而Yang等[22]研究則顯示，PD-L1陽性的早期肺腺癌患者無進展生存期更長；Velcheti等[23]研究亦發現，PD-L1陽性的非小細胞癌患者生存時間更長。但Konishi等[24]研究則認為，PD-L1與肺癌患者預后無明顯相關性。這些研究結果不一致可能與PD-L1的表達易受腫瘤樣本質量、腫瘤病理類型及腫瘤異質性等因素影響有關。目前單獨研究PD-L1對肺鱗癌患者預后影響的報道甚少。本研究發現，PD-L1陽性、有淋巴結轉移、pTNM分期較晚的肺鱗癌患者生存時間較短，是影響肺鱗癌患者預后的獨立危險因素。進一步提示PD-L1與肺鱗癌的發生、發展及患者預后相關。

近年來，隨著EGFR、ROS1、AKL等基因突變在肺腺癌中的深入研究，針對非小細胞肺癌基因檢測的關注達到了前所未有的高度，相應的靶向藥物研發也取得了巨大進步，明顯改善了患者的預后。近期研究發現，非小細胞肺癌PD-L1的表達與驅動基因有一定相關性，且與靶向藥物的療效有關。Tang等[25]研究發現，在非小細胞肺癌組織中PD-L1的表達與EGFR突變存在明顯相關性。Ota等[26]研究發現，PD-L1在EML4-ALK陽性的非小細胞肺癌細胞株中表達較EML4-ALK陰性的非小細胞肺癌細胞株明顯升高，并且干擾EML4-ALK的表達可導致PD-L1表達下降。有研究還發現，非小細胞肺癌患者靶向藥物的療效與PD-L1的表達密切相關，在存在EGFR突變且給予EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療的晚期非小細胞肺癌患者中，PD-L1陽性者疾病進展時間及總生存時間均優于PD-L1陰性者[27]，提示PD-L1在篩選靶向藥物優勢人群方面有著潛在的臨床價值，并且在靶向藥物耐藥性日益嚴重的今天，免疫藥物治療可能會在抗腫瘤治療中取得突破，抗PD-L1藥物可能在未來與靶向藥物的聯合應用中有著巨大前景。在小鼠模型中，應用抗PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1信號通路，能夠增強效應T細胞功能，改善腫瘤免疫微環境，使腫瘤小鼠的生存期明顯延長[28,29]。目前抗PD-L1藥物如MPDL3280A、BMS-936559等已進入臨床試驗階段，但有關抗PD-1/PD-L1藥物的治療主要局限在肺腺癌方面，在肺鱗癌方面的研究尚缺乏，有待于大規模的臨床試驗。

綜述所述，PD-L1的高表達與肺鱗癌的發生、發展及不良預后密切相關，PD-L1陽性表達提示肺鱗癌患者預后較差，PD-L1陽性表達有可能成為判斷肺鱗癌預后的重要的分子學標志。

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Expression of PD-L1 in pulmonary squamous-cell carcinoma and its correlation with clinicopathological features and prognosis

WANGLingling,GAOYing,SHENBing,CHANGHong

(BeijingShijitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China)

Objective To investigate the effect of programmed death ligand-1 (PD-L1) in the occurrence and development of pulmonary squamous-cell carcinoma. Methods PD-L1 protein expression was detected in 90 cases of pulmonary squamous-cell carcinoma and 15 cases of normal lung tissues by immunohistochemistry. The relationship of PD-L1 protein expression with clinicopathological features and prognosis was evaluated, and Kaplan-Meier method was used for the survival analysis. The independent prognostic factors of pulmonary squamous carcinoma were analyzed by Cox regression model. Results The positive expression of PD-L1 was 66.67% (60/90) in the pulmonary squamous-cell carcinoma tissues, and the expression of PD-L1 in the normal lung tissues was negative (P<0.05). The expression of PD-L1 was not related with gender, age, smoking history or tumor diameter (allP>0.05), but was closely correlated with lymph nodes metastasis and pTNM stage (allP<0.05). The median survival time of patients with PD-L1 positive expression was significantly lower than that of patients with negative expression (P<0.05). Multivariate Cox regression analysis showed that PD-L1 positive, lymph node metastasis and pTNM stage were independent prognostic factors for patients with lung squamous-cell carcinoma (allP<0.05). Conclusion The expression of PD-L1 is significantly increased in pulmonary squamous-cell carcinoma, which can promote the progression and metastasis of lung squamous-cell carcinoma and help to determine the prognosis of patients.

pulmonary squamous-cell carcinoma; programmed death ligand-1; clinicopathological features; prognosis

國家自然科學基金資助項目(81101480)。

王玲玲(1983-)，女，主治醫師，研究方向為腫瘤病理學。E-mail： wanglingling_1983@yeah.net

昌紅(1961-)，女，主任醫師，研究方向為腫瘤病理學。E-mail： changhongblk@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.007

R734.2

A

1002-266X(2017)08-0025-04

2016-07-24)