杜仲葉綠原酸提取物聯(lián)合西紅花苷對肝癌細胞膽固醇代謝的影響

賴玲林，肖苑，彭小芳，冷恩念，莫鎮(zhèn)濤，李文娜，陳陽，李意奇

(1遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東珠海519041；2廣東省第二人民醫(yī)院；3貴州省人民醫(yī)院)

杜仲葉綠原酸提取物聯(lián)合西紅花苷對肝癌細胞膽固醇代謝的影響

賴玲林1，2，肖苑3，彭小芳1，冷恩念1，莫鎮(zhèn)濤1，李文娜1，陳陽1，李意奇1

(1遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東珠海519041；2廣東省第二人民醫(yī)院；3貴州省人民醫(yī)院)

目的 觀察杜仲葉綠原酸提取物(CAEF)聯(lián)合西紅花苷對人肝癌細胞HepG2膽固醇代謝的影響，并探討其可能的作用機制。方法 將人肝癌細胞HepG2隨機分為空白對照組、油酸誘導組、辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組。油酸誘導組、辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組分別加入油酸誘導脂肪變性模型；同時，辛伐他汀組加入10 μmol/L的辛伐他汀10 μL，CAEF組加入25 mg/L 的CAEF 10 μL，聯(lián)合用藥組加入含1 μmol/L西紅花苷、30 μmol/L綠原酸、10 μmol/L京尼平苷、10 μmol/L槲皮素的混合液10 μL；空白對照組僅加入等體積培養(yǎng)基。取各組干預48 h細胞，行油紅O染色，檢測細胞內中性脂滴含量。取干預24、48 h細胞上清液，檢測TC、TG含量。采用RT-PCR法檢測膽固醇代謝相關基因(ABCA1、SREBP2、CYP7A1、LXRα、AMPK2α、HMGCR)表達，免疫細胞化學法和Western blotting法檢測HMGCR蛋白表達。結果 辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組干預48 h，細胞內中性脂滴含量明顯降低，其作用強度依次為聯(lián)合用藥組>CAEF組>辛伐他汀組(P均<0.05)；與對照組比較，CAEF組、聯(lián)合用藥組干預24、48 h時細胞外液TC、TG含量明顯增加，細胞外液TC、TG含量依次為聯(lián)合用藥組>CAEF組>辛伐他汀組(P均<0.05)。CAEF組、聯(lián)合用藥組ABCA1、CYP7A1、AMPK2α mRNA表達明顯升高，SREBP2、HMGCR mRNA表達明顯降低(P均<0.05)；此外，聯(lián)合用藥組LXRα mRNA表達明顯降低(P<0.05)。辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組HMGCR蛋白表達明顯降低，以聯(lián)合用藥組降低最明顯(P均<0.05)。結論 CAEF聯(lián)合西紅花苷可協(xié)同抑制肝癌細胞脂質積聚，其作用機制可能與調控肝癌細胞膽固醇代謝相關基因和蛋白的表達有關。

脂類代謝紊亂；肝癌細胞；杜仲葉；綠原酸提取物；西紅花苷

藥用杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，具有補益肝腎、強筋壯骨、調理沖任、固經安胎等功效，是中國名貴的滋補藥材，早在《神農本草經》里就有記載。杜仲皮含有綠原酸、槲皮素、京尼平苷等多種活性成分，杜仲葉中亦含有類似的活性成分，由于杜仲皮資源較匱乏，而杜仲葉資源豐富且容易取得，故杜仲葉取代杜仲皮已被認可[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明，杜仲葉具有降壓、調脂等作用，這些作用可能與其含有綠原酸、槲皮素、京尼平苷等有關[2]。西紅花苷主要存在于西紅花、梔子等植物中，具有保護心血管、抗腫瘤等作用，同時能降低胰脂酶活性，促進膽汁酸排泄，抑制膽固醇合成[3]。但目前國內外鮮見關于二者聯(lián)合應用的報道。2013年1月～2016年1月，我們觀察了杜仲葉綠原酸提取物(CAEF)聯(lián)合西紅花苷對人肝癌細胞HepG2膽固醇代謝的影響，并初步分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞，由遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)中心實驗室提供，儲存于液氮中。主要藥品：CAEF(綠原酸含量>42.4%)、西紅花苷(含量>98%)，由本課題組前期制備；綠原酸(含量>98%)，上海金穗生物科技有限公司。主要儀器：PCR儀，杭州博日科技有限公司；紫外分光光度計，日本島津公司；核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司；電泳儀，上海天能科技有限公司；全自動酶標儀，美國BioTek公司。相關引物及試劑：全部引物設計及合成，上海生工生物工程股份有限公司；TC、TG試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司；TRIzol Reagent RNA提取試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；免疫組化染色試劑盒、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)一抗，北京博奧森生物技術有限公司；油紅O，美國Sigma公司。

1.2 HepG2細胞內中性脂滴含量及細胞外液TC、TG含量檢測 ①細胞內中性脂滴含量：采用油紅O染色法。取HepG2細胞制備細胞懸液，調整密度為1×105個/mL，接種于6孔板，每孔3 mL。隨機將細胞分為空白對照組、油酸誘導組、辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁后，除空白對照組外，其余各組分別加入油酸10 μL誘導脂肪變性模型，同時辛伐他汀組加入10 μmol/L的辛伐他汀10 μL，CAEF組加入25 mg/L的 CAEF 10 μL，聯(lián)合用藥組加入含1 μmol/L的西紅花苷、30 μmol/L的綠原酸、10 μmol/L的京尼平苷、10 μmol/L的槲皮素混合液10 μL[4～6]；空白對照組僅加入培養(yǎng)基10 μL。各組均干預48 h，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，加入油紅O工作液(三蒸水∶油紅=2∶3)染色，鏡下觀察拍照。采用Image軟件分析圖像，以圖像光密度(OD)值表示細胞內中性脂滴的含量。②細胞外液TC、TG含量：取空白對照組、辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組干預24、48 h細胞培養(yǎng)液，采用全自動酶標儀檢測TC、TG含量。所有操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.3 膽固醇代謝相關基因的表達檢測 采用RT-PCR法[5]。取空白對照組、辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組干預48 h細胞，按TRIzol法提取細胞總RNA，根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說明逆轉錄為cDNA。在GenBank上查詢ATP結合盒轉運子A1(ABCA1)、固醇調節(jié)元件結合蛋白2(SREBP2)、膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)、肝X受體α(LXRα)、腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPK2α)、HMGCR基因序列。引物序列：ABCA1上游引物：5′-AGGCCCAGACCTGTAAATGC-3′，下游引物：5′-CTCACCAACCTTGCCAACTTC-3′，產物長度450 bp；SREBP2上游引物：5′-CAGACGCCAAGATGCACAAG-3′，下游引物：5′-TGGCTCATCTTTGACCTTTGC-3′，產物長度323 bp；CYP7A1上游引物：5′-CATTTGGGCACAGAAGCATTG-3′，下游引物：5′-AGGCAGCGGTCTTTGAGTTAG-3′，產物長度174 bp；LXRα上游引物：5′-AAGAAACTGAAGCGGCAAGA-3′，下游引物：5′-AGCAATGAGCAAGGCAAACT-3′，產物長度555 bp；AMPK2α上游引物：5′-TCAATCG->TTCTGTCGCCAC-3′，下游引物：5′-ATACGGTTTGCTCTGACTTCG-3′，產物長度530 bp；HMGCR上游引物：5′-CTCCGCAGGCTATTTGTTCAG-3′，下游引物：5′-GCTAAGAGCGTTCGTGGGTC-3′，產物長度620 bp；GAPDH上游引物：5′-ACTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′，下游引物：5′-CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3，產物長度182 bp。PCR反應體系共10 μL：2×Premix EX TaqTM5.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L) 1.0 μL，PCR Reverse(10 μmol/L) 1.0 μL，cDNA templates 0.5 μL；dH2O 2.5 μL；反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s(SREBP2、NR1H3)、57 ℃ 30 s(ABCA1、PRKAA2、HMGCR)或58 ℃ 30 s(CYP7A1)，72 ℃ 45 s，共32個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，紫外透射儀上觀察照相，采用Quality One軟件對圖像進行灰度值分析。以GAPDH為內參，計算ABCA1、SREBP2、CYP7A1、LXRα、AMPK2α、HMGCR mRNA的相對表達量。

1.4 HMGCR蛋白表達檢測 ①免疫細胞化學法。取空白對照組、辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組干預48 h細胞，甲醛固定，0.5% TritonX-100孵育15 min，3%過氧化氫孵育10 min，山羊血清封閉液孵育10 min，1∶50稀釋的HMGCR一抗4 ℃孵育過夜，生物素化二抗孵育30 min，辣根酶標記鏈霉卵白素孵育30 min，室溫DAB顯色25 min，蘇木素復染，流水沖洗返藍，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照，使用Image軟件分析圖像。②Western blotting法。取空白對照組、辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組干預48 h細胞，按照試劑盒說明提取細胞蛋白，BCA法定量。蛋白變性后，經SDS-PAGE電泳分離并轉膜，封閉后分別加入一抗、二抗孵育，ECL顯色，暗室壓片。采用Quantity One軟件分析圖像。

2 結果

2.1 各組細胞內中性脂滴及細胞外液TC、TG含量比較 見表1。

表1 各組細胞內中性脂滴及細胞外液TC、TG含量比較±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與油酸誘導組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，△P<0.05；與CAEF組比較，▲P<0.05；與同指標作用24 h比較，▽P<0.05。

2.2 各組ABCA1、SREBP2、CYP7A1、LXRα、AMPK2α、HMGCR mRNA表達比較 見表2。

表2 各組ABCA1、SREBP2、CYP7A1、LXRα、AMPK2α、HMGCR mRNA的相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與辛伐他汀組比較，#P<0.05；與CAEF組比較，△P<0.05。

2.3 各組HMGCR表達比較 免疫細胞化學法結果顯示，空白對照組HMGCR的相對表達量為0.020±0.020，辛伐他汀組為0.008±0.010，CAEF組為0.011±0.010，聯(lián)合用藥組為0.010±0.010；Western blotting法結果顯示，空白對照組HMGCR的相對表達量為0.760±0.090，辛伐他汀組為0.450±0.060，CAEF組為0.650±0.050，聯(lián)合用藥組為0.520±0.050。與對照組相比，辛伐他汀組、CAEF組、聯(lián)合用藥組HMGCR的相對表達量明顯降低，但聯(lián)合用藥組降低效果最明顯(P均<0.05)。

3 討論

杜仲葉含有多種有效成分，本課題組前期研究表明，CAEF在體外抑制胰脂酶活性、抗氧化等作用均強于綠原酸純品，故推測CAEF的藥效可能為多種有效組分綜合作用的結果[5]。有研究報道，杜仲葉發(fā)揮調脂作用的主要活性物質可能為綠原酸、槲皮素、京尼平苷[7]。梔子的主要有效成分為西紅花苷，具有較好的調脂活性。但二者聯(lián)合應用是否具有協(xié)同效應相關研究較少。

油紅O染色發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組和CAEF組均能使HepG2細胞內中性脂滴含量降低，且作用明顯強于辛伐他汀組。進一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥對HepG2細胞作用48 h，可顯著增加TC、TG外排量，其作用明顯強于單用CAEF或辛伐他汀，且對TC的抑制作用強于TG，與油紅O染色結果基本一致。

ABCA1可參與膽固醇逆轉運(RCT)的初始階段，即將細胞內的膽固醇通過跨膜轉運運輸?shù)紿DL，在HDL-C合成和RCT中發(fā)揮重要作用。增加ABCA1的活性不僅可使巨噬細胞中膽固醇外流增加，提高RCT；還可使腸黏膜細胞中膽固醇分泌增加，膽固醇吸收減少[8]。CYP7A1是膽汁酸合成經典途徑的限速酶，增加其活性，可促進膽固醇向膽汁酸轉化，進而降低體內膽固醇的含量[9]。AMPK是調控體內能量代謝的重要蛋白激酶，催化活性部位AMPK2α亞單位與體內TC、TG的代謝密切相關[10]。正常肝細胞脂質含量的穩(wěn)定依賴SREBPs的調節(jié)，SREBPs位于細胞內質網上，可調控體內膽固醇、自由脂肪酸(FFA)和TG等合成。其中SREBP1主要調控FFA和TG合成，SREBP2主要調控膽固醇代謝，其靶基因包括與TC合成相關的一系列酶，如HMGCR[11]。HMGCR是體內合成膽固醇的限速酶，該酶主要存在于肝臟、小腸等組織細胞中，能將HMG-CoA轉化為甲羥戊酸，通過甲羥戊酸途徑最終生成膽固醇，降低其活性可直接減少體內膽固醇的合成[12]。LXRα作為轉錄因子，其靶基因包括HMGCR、ABCA1、CYP7A1和SREBP2等基因，抑制其活性可降低體內脂質含量[13]。本研究CAEF組和聯(lián)合用藥組SREBP2、HMGCR mRNA表達均降低， ABCA1、CYP7A1、AMPK2α mRNA表達均升高。提示CAEF聯(lián)合西紅花苷可能通過上調ABCA1 mRNA表達使肝細胞中TC外排增加；上調CYP7A1 mRNA表達而促進肝臟內TC轉化；上調AMPK2α mRNA表達而改善脂質水平，進而起到調節(jié)血漿TC的作用；二者還能通過SREBP2信號通路抑制體內成脂相關基因的表達，減少細胞內脂質積聚。本研究聯(lián)合用藥組還能下調LXRα mRNA表達，而CAEF組和辛伐他汀組LXRα mRNA表達無明顯變化，說明CAEF聯(lián)合西紅花苷可能通過活化AMPK抑制其下游靶基因LXRα-SREBPs-HMGCR的表達，減少細胞內TC和TG合成，從而發(fā)揮調脂作用。

目前臨床上最常用的調脂藥物是HMGCR抑制劑，即他汀類藥物(如辛伐他汀)，其對LDL-C、TC等調節(jié)作用較強，目前對其機制的研究主要集中于對HMGCR表達的調控上。本研究CAEF組和聯(lián)合用藥組HMGCR表達降低，以聯(lián)合用藥組降低更明顯。由此推測，在脂代謝調控中西紅花苷發(fā)揮了重要作用，西紅花苷與CAEF具有良好的協(xié)同作用。

綜上所述，CAEF聯(lián)合西紅花苷可協(xié)同抑制肝癌細胞脂質積聚，其機制可能與調控肝癌細胞膽固醇代謝相關基因和蛋白的表達有關。

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Influence of chlorogenic acid extracted from Folium eucommiae and crocin on cholesterol metabolism of hepatoma carcinoma cells

LAILinglin1,XIAOYuan,PENGXiaofang,LENGEnnian,MOZhentao,LIWenna,CHENYang,LIYiqi

(1ZunyiMedicalCollegeZhuhaiCampus,Zhuhai519041,China)

Objective To observe the influence of chlorogenic acid extracted from Folium eucommiae (CAEF) and crocin on cholesterol metabolism in human hepatoma carcinoma HepG2 cells and to discuss the possible mechanism. Methods The HepG2 cells were randomly divided into five groups: the control group, the oleic acid group, the simvastatin group, the CAEF group and the combined administration group. In the oleic acid group, simvastatin group, CAEF group and combined administration group were added with oleic acid to induce steatosis models. At the same time, the simvastatin group was treated with 10 μmol/L simvastatin 10 μL , CAEF group was added with 25 mg/L CAEF 10 μL, the combined administration group was treated with 10 μL mixed solution including 1 μmol/L crocin, 30 μmol/L chlorogenic acid, 10 μmol/L geniposide and 10 μmol/L quercetin, and the control group was added with an equal volume of medium. The content of intracellular lipid droplets of HepG2 cells was observed by the oil red O staining after 48 h. The levels of triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in HepG2 cells were detected after 24 and 48 h. The expression of cholesterol metabolism-related genes, including ABCA1, SREBP2, CYP7A1, LXRα, AMPK2α, and HMGCR was measured by RT-PCR. The protein expression of HMGCR was detected by immunocytochemistry and Western blotting. Results The content of intracellular lipid droplets in the simvastatin group, the CAEF group and the combined administration group was significantly decreased after 48 h (the combined administration group > the CAEF group > the simvastatin group). Compared with the control group, the content of TC and TG was significantly increased in the other three groups after 24 h and 48 h (the combined administration group > the CAEF group> the simvastatin group, allP<0.05). The mRNAs expression of ABCA1, CYP7A1 and AMPK2α was significantly increased, while the mRNAs expression of SREBP2 and HMGCR was significantly decreased in the combined administration group and in the CAEF group after 48 h (allP<0.05). The mRNAs expression of LXRα was significantly decreased in the combined administration group (P<0.05). The protein expression of HMGCR in the three groups was significantly decreased and the combined administration group showed the strongest inhibitory effect (allP<0.05). Conclusions CAEF and crocin have synergistic inhibition effect on the lipid accumulation in HepG2 cells. The regulation of cholesterol metabolism-related genes and protein expression may be one of the mechanisms.

lipid metabolism disorders; hepatoma carcinoma cells; Folium eucommiae; chlorogenic acid extract; crocin

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產業(yè)研究開發(fā)專項項目(黔科合ZY字[2013]3018號)；珠海市優(yōu)勢學科建設計劃。

賴玲林(1985-)，女，碩士，研究方向為心血管藥理學及新藥研發(fā)。E-mail: 369027702@qq.com

李文娜(1977-)，女，教授，研究方向為心血管藥理學及新藥研發(fā)。E-mail： lielizabeth@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.005

R589

A

1002-266X(2017)08-0017-04

2016-10-10)