血清HBcrAg、線性化HBsAg對隱匿性乙型肝炎的診斷價值

朱嫦琳，薛雄燕，陳展?jié)?，谷愉愉，許揚揚，李煒煊

(1佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山528000；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院)

血清HBcrAg、線性化HBsAg對隱匿性乙型肝炎的診斷價值

朱嫦琳1，薛雄燕1，陳展?jié)?，谷愉愉2，許揚揚1，李煒煊1

(1佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山528000；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院)

目的 探討血清乙肝病毒核心相關(guān)抗原(HBcrAg)及線性化乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)對隱匿性乙型肝炎(OBI)的診斷價值。方法 選擇OBI患者63例(OBI組)、體檢健康者150例(對照組)，采用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法檢測兩組血清HBcrAg、線性化HBsAg，采用熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析HBcrAg、線性化HBsAg二者單獨及聯(lián)合檢測對OBI的診斷效能。結(jié)果 OBI組和對照組血清HBcrAg陽性率分別為90.5%和10.7%，線性化HBsAg陽性率分別為42.9%和6.0%，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為125.5、42.9，P均<0.05)。相關(guān)分析顯示，HBV DNA與HBcrAg、HBV DNA、線性化HBsAg均呈正相關(guān)(R2分別為0.471 4、0.122 2、0.086 8，P<0.05或<0.01)。ROC曲線分析顯示，血清HBcrAg、線性化HBsAg診斷OBI的曲線下面積(AUC)分別為0.911(95%CI為0.864～0.946)、0.683(95%CI為0.616～0.745)，二者聯(lián)合檢測診斷OBI的AUC為0.895(95%CI為0.846～0.933)，血清HBcrAg對OBI的診斷效能顯著優(yōu)于線性化HBsAg(Z=6.134，P<0.05)，二者聯(lián)合檢測并不能提高其對OBI的診斷效能(Z=0.657，P>0.05)。當(dāng)血清HBcrAg、線性化HBsAg的最佳臨界值分別為100 U/mL、0.48 IU/mL時，血清HBcrAg診斷OBI的敏感性顯著高于線性化HBsAg(χ2=121.4，P<0.05)，特異性稍低于線性化HBsAg(χ2=3.034，P>0.05)，二者聯(lián)合檢測診斷OBI的敏感性和特異性較單獨檢測HBcrAg并未明顯提高(χ2分別為1.322、3.802，P均>0.05)。結(jié)論 血清HBcrAg與HBV DNA存在良好的相關(guān)性，對OBI的診斷效能優(yōu)于線性化HBsAg，但聯(lián)合檢測HBcrAg、線性化HBsAg并不能提高其診斷效能；血清HBcrAg可單獨作為診斷OBI的血清學(xué)指標(biāo)。

隱匿性乙型肝炎；乙肝病毒核心相關(guān)抗原；線性化乙型肝炎病毒表面抗原

隱匿性乙型肝炎(OBI)是乙肝病毒(HBV)感染的一種特殊形式，表現(xiàn)為乙肝病毒表面抗原(HBsAg)陰性而HBV DNA陽性[1]。OBI可通過垂直傳播、輸血、器官移植等途徑傳播病毒，且與慢性肝病、肝癌等發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2，3]。由于一般血清HBV標(biāo)志物不能有效檢出OBI[4]，目前診斷OBI時需采用實時熒光定量PCR法檢測HBV DNA[5]，基層醫(yī)院無法開展。乙肝病毒核心相關(guān)抗原(HBcrAg)包含乙肝病毒核心抗原(HBcAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)和p22cr蛋白，與肝組織cccDNA含量、HBV DNA具有良好的相關(guān)性[6]。線性化HBsAg是經(jīng)過理化因素處理HBsAg，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部隱藏的抗原表位被暴露，可提高HBV檢出率[7]。本研究探討血清HBcrAg、線性化HBsAg對OBI的診斷價值，旨在為OBI診斷提供更便捷的方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年3月～2015年12月佛山市第一人民醫(yī)院收治的OBI患者63例(OBI組)。均符合OBI診斷標(biāo)準(zhǔn)，即HBsAg陰性、HBV DNA陽性。排除合并急慢性肝炎、肝硬化、肝癌及其他肝臟疾病者。其中，男37例、女26例，年齡19～63(33.2±13.1)歲。同期選擇在該院體檢的健康者150例(對照組)，男92例、女58例，年齡18～65(34.6±12.9)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 血清HBcrAg、線性化HBsAg檢測 所有研究對象清晨空腹采集肘靜脈血4～5 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存待測。血清HBcrAg、線性化HBsAg檢測采用LUMIPULSE G1200型全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)及配套試劑，血清HBV DNA檢測采用ABI公司7300型實時熒光定量PCR儀。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。結(jié)果判定：HBcrAg>100 U/mL為陽性，線性化HBsAg>5 IU/mL為陽性，HBV DNA>500 copies/mL為陽性；計算HBcrAg及線性化HBsAg陽性率，并分析HBV DNA、HBcrAg及線性化HBsAg之間的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析HBcrAg和線性化HBsAg對OBI的診斷效能，并確定最佳臨界值(cut-off值)，ROC曲線下面積(AUC)比較采用Hanley和McNeilZ檢驗。ROC曲線分析采用MedCalc15.2.2軟件。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清HBcrAg及線性化HBsAg陽性率比較 OBI組和對照組血清HBcrAg陽性率分別為90.5%(57/63)、10.7%(16/150)，線性化HBsAg陽性率分別為42.9%(27/63)、6.0%(9/150)。兩組HBcrAg、線性化HBsAg陽性率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為125.5、42.9，P均<0.01)。

2.2 HBV DNA、HBcrAg及線性化HBsAg的關(guān)系 HBV DNA與HBcrAg經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，Spearman等級相關(guān)分析顯示，所有研究對象HBV DNA與HBcrAg、線性化HBsAg均呈正相關(guān)關(guān)系(R2分別為0.471 4、0.122 2，P均<0.01)，HBcrAg與線性化HBsAg亦呈正相關(guān)關(guān)系(R2=0.086 8，P<0.01)。見圖1。

圖1 HBV DNA、HBcrAg及線性化HBsAg的關(guān)系

2.3 血清HBcrAg及線性化HBsAg的ROC曲線分析 血清HBcrAg、線性化HBsAg及二者聯(lián)合檢測診斷OBI的ROC曲線見圖2。血清HBcrAg診斷OBI的AUC為0.911(95%CI為0.864～0.946)，線性化HBsAg診斷OBI的AUC為0.683(95%CI為0.616～0.745)，二者聯(lián)合檢測診斷OBI的AUC為0.895(95%CI為0.846～0.933)，血清HBcrAg對OBI的診斷效能明顯高于線性化HBsAg(Z=6.134，P<0.01)，二者聯(lián)合檢測并不能提高其對OBI的診斷效能(Z=0.657，P>0.05)。以血清HBcrAg、線性化HBsAg的最佳臨界值(cut-off值)分別為100 U/mL、0.48 IU/mL時，血清HBcrAg診斷OBI的敏感性、特異性分別為91.94%、89.40%，線性化HBsAg診斷OBI的敏感性、特異性分別為41.94%、94.04%，二者聯(lián)合檢測的敏感性、特異性分別為88.71%、82.72%。血清HBcrAg診斷OBI的敏感性高于線性化HBsAg(χ2=121.4，P<0.01)，但特異性稍低于線性化HBsAg(χ2=3.034，P>0.05)；二者聯(lián)合檢測診斷OBI的敏感性和特異性并未比單獨檢測HBcrAg有所提高(χ2分別為1.322、3.802，P均>0.05)。

圖2 血清HBcrAg、線性化HBsAg及二者聯(lián)合檢測診斷OBI的ROC曲線分析

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，全世界約1/3的人群存在既往感染HBV證據(jù)，其中超過1/3的HBV攜帶者來自我國，是我國急慢性肝炎、肝硬化和肝癌等患者人數(shù)眾多的主要原因之一[8]。OBI是HBV感染的一種特殊形式，表現(xiàn)為血清HBV DNA陽性、HBsAg陰性，可伴有或不伴有anti-HBc陽性，是HBV通過輸血傳播的重要原因之一。OBI的感染率與HBV流行率密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，我國HBsAg陽性率高達7.2%，HBV DNA陽性率亦逐年遞增[9，10]。HBsAg的高流行狀態(tài)提示OBI感染率可能較高。前期研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg陰性而anti-HBc陽性的人群中，HBV DNA的陽性率高達70.4%[11]；廣州血液中心調(diào)查發(fā)現(xiàn)，篩檢HBsAg陽性后，OBI的發(fā)生風(fēng)險仍有0.061%[12]；深圳市血液中心對無償獻血者標(biāo)本進行HBV DNA篩查發(fā)現(xiàn)，初次獻血者OBI發(fā)生率達0.105%[13]。以上結(jié)果提示，OBI在我國并不少見。OBI患者以現(xiàn)有的HBsAg檢測方法結(jié)果均為陰性，但肝臟中存在HBV DNA復(fù)制，血清中也能檢測到HBV DNA，極有可能發(fā)生HBV感染，是導(dǎo)致經(jīng)HBsAg篩查后仍有HBV傳播風(fēng)險的主要原因之一[14,15]。此外，在實際臨床工作中，HBsAg篩查為陰性者多不進行HBV DNA定量檢查，導(dǎo)致OBI漏診。

血清HBcrAg并非一種蛋白，其主要包含HBcAg、HBeAg和p22cr蛋白，這3種蛋白共享149個由前C/C區(qū)編碼的氨基酸序列，其中p22cr蛋白常存在于HBV DNA陰性的病毒顆粒中。有研究發(fā)現(xiàn)，血清HBcrAg水平與肝組織cccDNA、HBV DNA及其他病毒學(xué)標(biāo)志物均具有良好的相關(guān)性，可用于評價乙肝患者病情和患者肝組織學(xué)狀態(tài)[16,17]。HBcrAg最初的檢測方法為酶聯(lián)免疫分析法，其與PCR法檢測HBV DNA具有相似的敏感性[18]。目前檢測HBcrAg最常用的方法為化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法，即使用單克隆抗體制成固相抗體，用另一株單克隆抗體標(biāo)記辣根過氧化物酶作為酶標(biāo)抗體，利用雙抗體夾心原理，通過測定發(fā)光強度計算樣品中HBcrAg的含量[19]，由于不受anti-HBc、anti-HBe和前C區(qū)突變的影響，敏感性和特異性均較高，且檢測為全自動化，無需專用實驗室和專人操作[20]。線性化HBsAg是經(jīng)過理化因素處理過的HBsAg。傳統(tǒng)HBsAg檢測方法所用抗體主要針對的抗原表位可能發(fā)生突變而導(dǎo)致檢測結(jié)果假陰性。線性化HBsAg檢測時，樣本通過變性處理，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，原來隱藏在內(nèi)部的抗原表位被暴露，采用針對這些表位的單抗復(fù)合物作為檢測抗體，可大大提高HBV的檢出率。有研究發(fā)現(xiàn)，線性化HBsAg與傳統(tǒng)HBsAg具有良好的相關(guān)性，可檢測經(jīng)抗病毒治療患者血清中的HBsAg，且敏感性比傳統(tǒng)方法提高10倍以上[21]。因此，線性化HBsAg檢測可作為因病毒變異或受HBsAg檢測方法限制，而導(dǎo)致無法進行OBI檢測的良好補充手段。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OBI組血清HBcrAg、線性化HBsAg陽性率均高于對照組，其中血清HBcrAg陽性率高達90.5%，表明血清HBcrAg對OBI診斷有較強的提示作用。由于受方法學(xué)限制，OBI患者血清HBsAg未能通過現(xiàn)有方法有效檢出，可能造成臨床上漏診，而HBcrAg檢測可對其有效補充，大大提高OBI的檢出率。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清HBV DNA、HBcrAg、線性化HBsAg三者兩兩均呈正相關(guān)關(guān)系，但HBcrAg與HBV DNA相關(guān)性更高。由于本研究納入的研究對象均未發(fā)生過急慢性肝炎且未經(jīng)過任何抗肝炎治療，因此認為，在自然狀態(tài)下HBcrAg與HBV DNA相關(guān)性良好，可反映血清HBV DNA水平，與文獻[20，22]報道基本一致。提示在開展HBV DNA檢測條件不足時，血清HBcrAg可作為較理想的替代手段。ROC曲線分析顯示，血清HBcrAg對OBI的診斷效能顯著優(yōu)于線性化HBsAg，二者聯(lián)合檢測并不能提高其對OBI的診斷效能，以血清HBcrAg的cut-off值為100 U/mL時，其診斷OBI的敏感性和特異性分別達到91.94%、89.40%，故臨床上可單獨用血清HBcrAg水平診斷OBI，而單獨或同時檢測血清線性化HBsAg對OBI的診斷價值不大。

綜上所述，血清HBcrAg在自然狀態(tài)下與HBV DNA存在良好的相關(guān)性，由于其檢測操作簡便，干擾因素少，敏感性和特異性高，無需專用實驗室和專人操作等，可在無法開展HBV DNA檢測時作為替代檢測。血清HBcrAg對OBI的診斷效能較好，可單獨作為診斷OBI的血清學(xué)指標(biāo)。由于本研究納入樣本量較少、樣本類型略有不足等，其結(jié)論仍需更多大樣本、多中心的研究數(shù)據(jù)進一步驗證。

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Diagnostic value of serum HBcrAg and linearized HBsAg for occult hepatitis B virus infection

ZHUChanglin1,XUEXiongyan,CHENZhanze,GUYuyu,XUYangyang,LIWeixuan

(1TheFirstPeople’sHospitalofFoshan,Foshan528000,China)

Objective To investigate the value of serum hepatitis B virus core-related antigens (HBcrAg) and linearized hepatitis B surface antigen (HBsAg) in diagnosis of occult hepatitis B virus infection (OBI) in Chinese population. Methods HBcrAg and linearized HBsAg levels were measured by chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) in 63 patients with OBI (OBI group) and 150 healthy people (control group). The serum HBV DNA was detected by fluorescence quantitative PCR. Receiver operating characteristics (ROC) was analyzed to calculate diagnostic accuracy of HBcrAg and combination with linearized HBsAg. Results Serum HBcrAg and linearized HBsAg were detected in 90.5% and 42.9% of the OBI group, and 10.7%, 6.0% of the control group, respectively (χ2=125.5, 42.9, allP<0.05). There were positive correlation between HBV DNA and HBcrAg, HBV DNA and linearized HBsAg, HBcrAg and linearized HBsAg, respectively (R2=0.471 4, 0.122 2, 0.086 8,P<0.05 orP<0.01). HBcrAg had better area under the ROC curves (AUC) [0.911 (95%CI: 0.864-0.946)] than linearized HBsAg [0.683 (95%CI: 0.616-0.745),Z=6.134,P<0.05]. The AUC of combined detection was 0.895 (95%CI: 0.846-0.933), and no significant improvement was found (Z=0.657,P>0.05). The optimal HBcrAg and linearized HBsAg cutoff values were 100 U/mL and 0.48 IU/mL, respectively. The sensitivity of HBcrAg in diagnosis of OBI was significantly higher than that of linearized HBsAg (χ2=121.4,P<0.01), while specificity was a little lower (χ2=3.034,P>0.05). Combined detection in diagnosis of OBI did not show any improvement than single detection of HBcrAg or linearized HBsAg in sensitivity or specificity (χ2=1.322, 3.802, allP>0.05). Conclusion There is a good correlation between serum HBcrAg and HBV DNA, and HBcrAg is more sensitive than linearized HBsAg or combined detection in diagnosis of OBI, which can be used as a good serological marker for the diagnosis of OBI.

occult hepatitis B virus infection; Hepatitis B virus core-related antigens; linearized hepatitis B surface antigen

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項項目(B2015127)。

朱嫦琳(1985-)，女，主管技師，研究方向為免疫學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail： changlin_zhu@126.com

李煒煊(1960-)，男，主任技師，研究方向為生化免疫學(xué)。E-mail： lwx21cn@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.003

R512.6

A

1002-266X(2017)08-0009-04

2016-07-07)