XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與胃癌鉑類藥物化療敏感性的關系

鐘蘭，黃濤，謝賢和，符生苗，高允鎖，吳華，鐘佩君

(1海南省人民醫院，海口570311；2福建醫科大學附屬第一醫院)

XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與胃癌鉑類藥物化療敏感性的關系

鐘蘭1，黃濤1，謝賢和2，符生苗1，高允鎖1，吳華1，鐘佩君1

(1海南省人民醫院，海口570311；2福建醫科大學附屬第一醫院)

目的 探討X射線損傷交叉互補蛋白1(XRCC1)Arg194Trp位點多態性與胃癌鉑類藥物化療敏感性的關系。方法 選擇接受鉑類藥物化療的胃癌患者80例，采用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應技術檢測XRCC1基因Arg194Trp位點基因型。所有患者術后接受以奧沙利鉑為主的一線化療方案，根據化療效果分為化療敏感者和化療耐藥者，分析XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與化療敏感性的關系。結果 XRCC1基因Arg194Trp位點存在Arg/Arg、Arg/Trp、Trp/Trp三種基因型，分布頻率分別為42.5%(34/80)、50.0%(40/80)、7.5%(6/80)；三種基因型分布滿足Hardy-Weiberg基因遺傳平衡定律，具有群體代表性。Arg/Arg、Arg/Trp、Trp/Trp基因型患者性別、年齡、組織類型、TNM分期、化療方案等臨床病理參數比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。80例患者中，化療敏感(完全緩解+部分緩解)39例(48.8%)，耐藥(穩定+進展)41例(51.2%)；Arg/Trp、Trp/Trp基因型者化療敏感率均顯著高于Arg/Arg者(P均<0.05)，Arg/Trp與Trp/Trp基因型患者化療敏感率比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論 XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與胃癌患者鉑類藥物化療敏感性有關；檢測Arg194Trp位點多態性可為胃癌化療的個體化用藥提供依據。

胃癌；X射線損傷交叉互補蛋白1；單核苷酸多態性；鉑類耐藥

胃癌病情隱匿，大部分患者確診時已屬進展期。化療是進展期胃癌的主要治療手段，可使患者生存明顯獲益[1～3]；以氟尿嘧啶和鉑類藥物為基礎的聯合化療是進展期胃癌的一線治療方案[4,5]。鉑類藥物進入細胞后主要通過引起DNA損傷而發揮抗腫瘤作用。如果腫瘤細胞DNA修復能力強，則化療效果較差，反之化療效果較好[6]。X射線損傷交叉互補蛋白1(XRCC1)是一種與堿基切除修復/單鏈斷裂修復直接有關的蛋白，可參與鉑類藥物引起的DNA損傷修復過程。研究發現，XRCC1基因Arg194Trp位點多態性可影響其堿基切除修復和單鏈斷裂修復能力，導致鉑類藥物化療耐藥[7,8]。本研究分析XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與胃癌鉑類藥物化療敏感性的關系，旨在探討胃癌鉑類藥物化療耐藥的遺傳機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2015年1月海南省人民醫院收治的胃癌患者80例。納入標準：①經術后組織病理檢查證實為胃腺癌；②至少有一個可測量病灶；③術前未接受過任何抗腫瘤治療，納入本研究后均行胃癌根治性切除并接受系統規范化治療；④預計生存期≥3個月；⑤年齡18歲以上，性別不限；⑥接受以奧沙利鉑為基礎的化療。排除標準：①骨髓造血功能不全者；②心、肝、腎功能明顯異常者；③妊娠、哺乳期婦女；④合并其他重要臟器疾病或急慢性感染未得到控制者；⑤合并胃癌以外的其他惡性腫瘤者；⑥有精神神經癥狀，治療依從性差者。其中，男52例、女28例，年齡28～75(53.5±7.9)歲；組織分化程度：高分化23例，中低分化57例；TNM分期[9]：Ⅱ期27例，Ⅲ期53例。

1.2 XRCC1基因Arg194Trp位點多態性檢測 采用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應(PCR-LDR)技術。患者化療前抽取外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸鈉抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，棄去白細胞層，置于1.5 mL EP管中，-30 ℃低溫冰箱保存備用。按Axygen全基因組DNA抽提試劑盒說明提取基因組DNA。引物和探針由上海生工生物工程股份有限公司設計、合成。rs1799782上游引物：5′-CAAGCTTGGCCAGTTCCG-3′，下游引物：5′-ACTACCCTCCTCCCTCAGAC-3′。PCR反應體系共20 μL：上下游引物各1 μL，dNTP 2 μL，Taq酶0.2 μL，基因組DNA溶液1 μL，1×Buffer 2 μL，Mg2+0.6 μL，ddH2O 12.2 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 90 s，65 ℃ 30 s，35個循環，最后65 ℃延伸10 min。多重LDR反應體系共10 μL：1×Buffer 1 μL，探針各1 μL，2 U DNA連接酶0.05 μL，ddH2O 4 μL，PCR產物4 μL。其中，上游探針為G C T G AAGAASAGAGCCCCCGGCCTCTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTT，G探針為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-T T T TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGATGTCTTGTTG-ATCC，A探針為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-T T T TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGATGTCTTG-TTGATCCA，充分混勻后短暫離心，95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，50 ℃ 25 s，共40個循環。取出1 μL LDR產物，利用測序儀檢測核苷酸序列，確定XRCC1基因Arg194Trp位點基因型。

1.3 化療方法及化療敏感性評價 于術后1～3天開始接受以奧沙利鉑為主的一線化療方案。51例行FOLFOX方案化療：奧沙利鉑130 mg/m2靜滴2 h，第1天；亞葉酸鈣130 mg/m2靜滴2 h，第1～5天；5-FU 300 mg/m2靜滴4 h，第1～5天。29例患者接受XELOX方案化療：奧沙利鉑130 mg/m2靜滴2 h，第1天；卡培他濱1 000 mg/m2口服，2次/d，第1～14天。FOLFOX與XELOX方案均以3周為1個周期。所有患者完成4個化療周期，參考實體瘤療效評價標準[10](RECIST 1.0)：完全緩解(CR)：所有目標病灶消失；部分緩解(PR)：基線病灶最大徑總和縮小≥30%；穩定(SD)：基線病灶最大徑總和縮小但未達PR程度，或有增加但未達進展(PD)程度。PD：基線病灶最大徑總和增加≥20%或出現新病灶，或存在非目標病灶進展。化療敏感指初次化療后獲得CR+PR，或初次化療6個月以上病情未進展；化療耐藥指初次化療期間獲得SD+PD，或6個月內腫瘤復發。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗樣本的群體代表性。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 XRCC1基因Arg194Trp位點基因型分布 野生型純合子Arg/Arg被酶切為1個508 bp的片段；突變型雜合子Arg/Trp被酶切為3個片段，分別為319、191、508 bp；突變型純合子Trp/Trp被酶切為2個片段，分別為319、191 bp。三種基因型分布頻率分別為Arg/Arg 34例(42.5%)，Arg/Trp 40例(50.0%)，Trp/Trp 6例(7.5%)，其基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=1.179，P>0.05)。見圖1。

注：M：marker；1、2：野生型純合子Arg/Arg；3、4：突變型雜合子Arg/Trp；5、6：突變型純合子Trp/Trp。

圖1 XRCC1基因Arg194Trp位點酶切電泳圖

2.2 XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與胃癌患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與胃癌患者臨床病理參數的關系[例(%)]

2.3 XRCC1基因Arg194Trp位點多態性與化療敏感性的關系 所有患者經4個周期化療，CR 0例，PR 39例，SD 24例，PD 17例，化療敏感39例，化療耐藥41例。其中，Arg/Arg基因型化療藥物敏感率為17.6%(6/34)、Arg/Trp基因型為70%(28/40)，Trp/Trp基因型為83.3%(5/6)。Arg/Trp、Trp/Trp基因型者化療藥物敏感率均高于Arg/Arg基因型者(χ2分別為20.282、11.037，P均<0.05)，而Arg/Trp基因型者與Trp/Trp基因型者化療藥物敏感率比較差異無統計學意義(χ2=0.457，P>0.05)。

3 討論

胃癌是全世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤之一。近年來，雖然胃癌的診療水平有所提高，但患者生存期仍然較短，特別是中晚期胃癌。中晚期胃癌患者多無法進行根治性切除，以鉑類為主的化療在其治療中具有不可替代的作用，但由于化療敏感性存在個體差異，故其療效不一[11]。近年研究發現，DNA損傷修復轉變可能是鉑類藥物化療耐藥的主要原因[12～14]。DNA損傷修復能力差的腫瘤患者手術治療后存活率不高，但經過輔助化療后，其療效明顯提升。韓婧等[15]研究發現，DNA損傷修復能力強的腫瘤患者接受單純手術治療后，雖然生存期長，但對輔助化療卻易產生耐藥性，其死亡風險是DNA損傷修復能力差者的2倍。DNA損傷修復有四種基本形式，即堿基切除修復、核苷酸切除修復、雙鏈斷裂修復和酶修復。XRCC1基因屬于堿基切除修復基因，其位于人染色體19q13.2-13.3，是由編碼633個氨基酸組成的蛋白質，全長約33 kb，包含17個外顯子[16]。XRCC1基因參與單鏈斷裂修復和堿基切除修復[17,18]。有研究表明，XRCC1基因可與含鉑的DNA雙鏈結合[19]。這些研究均提示，XRCC1基因可能與鉑類介導的DNA損傷修復相關[20]。目前，XRCC1基因中共發現3個多態性位點，分別為G27466A、C26304T及G28152A，分別導致相應氨基酸殘基的改變[21～23]。單核苷酸多態性是人類遺傳常見的多態形式[24,25]，由單核苷酸引起的DNA多態性可導致個體對惡性腫瘤易感性、化療/射線敏感性存在差異，進而影響腫瘤的治療效果。Pramanik等[26]研究認為，XRCC1基因Arg194Trp位點多態性能夠引起所編碼的氨基酸發生變化，導致XRCC1蛋白功能破壞，從而使DNA的修復功能減弱，避免鉑類藥物化療耐藥，提高了藥物的敏感性。

本研究顯示，胃癌XRCC1基因Arg194Trp位點主要存在三種基因型：野生型純合子Arg/Arg、突變型雜合子Arg/Trp和突變型純合子Trp/Trp，其中Arg/Arg占42.5%， Arg/Trp占50.0%，Trp/Trp占7.5%。成莉等[27]研究發現，卵巢癌XRCC1基因Arg194Trp位點有Arg/Trp、Trp/Trp、Arg/Arg三種基因型，其分布頻率分別為47.6%、43.9%和8.5%，說明Arg194Trp位點多態性可能是惡性腫瘤某些生物學行為改變的原因。本研究中，Arg/Arg、Arg/Trp、Trp/Trp基因型胃癌患者性別、年齡、組織類型、TNM分期、化療方案等臨床資料比較差異均無統計學意義，說明Arg194Trp位點多態性可能與胃癌的TNM分期、組織分化程度無關。魏嘉等[28]研究認為，攜帶A突變等位基因是患者預后差、組織學分級較高的獨立危險因素。黃朝暉等[29]研究亦證實，XRCC1基因第6個外顯子Arg194Trp堿基出現突變會導致DNA修復功能受到損傷，并增加機體對胃癌的易感性。本研究所選擇的樣本量偏少，可能是導致結果與既往報道不完全一致的主要原因。因此，還需要增加樣本量以進一步證實研究結果的可靠性。本研究還發現，Arg/Trp、Trp/Trp基因型者化療藥物敏感率顯著高于Arg/Arg基因型者，而Arg/Trp基因型者與Trp/Trp基因型者化療藥物敏感率比較差異無統計學意義，說明XRCC1基因Arg194Trp位點突變型者鉑類藥物化療敏感性高于野生型者。

綜上所述，XRCC1基因Arg194Trp位點與鉑類藥物化療敏感性有關；檢測Arg194Trp位點多態性可為胃癌化療的個體化用藥提供依據。

[1] 王超，任彩麗，王宏革，等.XRCC1基因和ERCC2基因多態與胃癌的研究[J].現代預防醫學，2014，41(15)：2800-2803.

[2] 李江奇，趙永勛，姜雷，等.中國人群X線交錯互補修復基因1 Arg399Gln多態性與胃癌易感性關系的Meta分析[J].蘭州大學學報(醫學版),2015,13(3)：64-68.

[3] 孫秀娣，牧人，周有尚，等.中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發展趨勢預測[J].中華腫瘤雜志，2004，26(4)：4-9.

[4] 劉仕鵬，鄒紹靜，趙建強，等.XRCC1基因單核苷酸多態性與食管癌易感性的關系[J].實用腫瘤雜志，2013，28(3)：253-260.

[5] 曾小云，余紅平，仇小強，等.XRCC1基因多態性與肝細胞癌的病例對照研究[J].中華疾病控制雜志，2010，11(8)：760-763.

[6] 樊曉妹,李魁秀,牛書懷,等.XRCC1基因多態性與宮頸癌發病風險及臨床病理因素的關系[J].中華醫學雜志，2013，93(43)：3454-3456.

[7] 韓光明，申茂艷，劉艷霞，等.中國人群非小細胞肺癌XRCC1基因多態性與鉑類藥物敏感性的Meta分析[J].中國藥業，2013，22(20)：26-31.

[8] 成莉,李琳,邢輝,等.XRCC1基因多態性與卵巢癌對鉑類藥物化療敏感性的相關性研究[J].臨床腫瘤學雜志，2014，13(4)：312-317.

[9] Chae S, Lee A, Lee JH. The effectiveness of the new (7th) UICC N classification in the prognosis evaluation of gastric cancer patients: a comparative study between the 5th/6th and 7th UICC N classification[J]. Gastric Cancer, 2011,14(2):166-171.

[10] Krajewski KM, Nishino M, Ramaiya NH, et al. RECIST 1.1 compared with RECIST 1.0 in patients with advanced renal cell carcinoma receiving vascular endothelial growth factor-targeted therapy[J]. AJR Am J Roentgenol, 2015,204(3):282-288.

[11] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[12] Nagasubramanian R, Innocenti F, Ratain MJ. Pharmacogenetics in cancer treatment[J]. Annu Rev Med, 2003(54):437-452.

[13] Marsh S, Mcleod HL. Cancer pharmacogenetics[J]. Br J Cancer, 2004,90(1):8-11.

[14] Park GY, Wilson JJ, Song Y, et al. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile[J]. Proc Natl Acad Sci, 2012,109(30):11987-11992.

[15] 韓婧，李江.DNA修復相關基因啟動子甲基化和腫瘤化療耐藥的進展[J].上海交通大學學報(醫學版)，2011，31(1)：95-98.

[16] Szaflik JP, Cuchra M, Przybylowska-Sygut K, et al. Association of the 399Arg/Gln XRCC1, the 194 Arg/Trp XRCC1, the 326Ser/Cys OGG1, and the 324Gln/His MUTYH gene polymorphisms with clinical parameters and the risk for development of primary open-angle glaucoma[J]. Mutat Res, 2013,753(1):12-22.

[17] Takahashi H, Kaniwa N, Saito Y, et al. Identification of a candidate single-nucleotide polymorphism related to chemotherapeutic response through a combination of knowledge-based algorithm and hypothesis-free genomic data[J]. J Biosci Bioeng, 2013,116(6):768-773.

[18] Moreno E, Tovar-Palacio C, de los Heros P, et al. A single nucleotide polymorphism alters the activity of the renal Na+: Cl-cotransporter and reveals a role for transmembrane segment 4 in chloride and thiazide affinity[J]. J Biol Chem, 2004,279(16):16553-16560.

[19] Savas S, Kim DY, Ahmad MF, et al. Identifying functional genetic variants in DNA repair pathway using protein conservation analysis[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2004,13(5):801-807.

[20] Caldecott KW, Aoufouchi S, Johnson P, et al. XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase beta and possibly poly (ADP-ribose) polymerase, and DNA ligase Ⅲ is a novel molecular nick-sensor in vitro[J]. Nucleic Acids Res, 1996,24(22):4387-4394.

[21] Zhu GY, Lippard SJ. Photoaffinity labeling reveals nuclear proteins that uniquely recognize cisplatin-DNA interstrand cross-Links[J]. Biochemistry, 2009,48(22):4916-4925.

[22] Bernig T, Chanock SJ. Challenges of SNP genotyping and genetic variation: its future role in diagnosis and treatment of cancer[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2006,6(3):319-331.

[23] Abdel-Rahman SZ, El-Zein RA. The 399 Gln polymorphism in the DNA repair gene XRCC1 modulates the genotoxic response induced in human lymphocytes by the tobacco-specific nitrosamine NNK[J]. Cancer Lett, 2000,159(1):63-71.

[24] Matullo G, Palli D, Peluso M, et al. XRCC1, XRCC3, XPD gene polymorphisms, smoking and (32)P-DNA adducts in a sample of healthy subjects[J]. Carcinogenesis, 2001,22(9):1437-1445.

[25] Ruzzo A, Graziano F, Kawakami K, et al. Pharmacogenetic profiling and clinical outcome of patients with advanced gastric cancer treated with palliative chemotherapy[J]. J Clin Oncol, 2006,24(12):1883-1891.

[26] Pramanik S, Devi S, Chowdhary S, et al. DNA repair gene polymorphisms at XRCC1, XRCC3, XPD, and OGG1 loci in Maharashtrian population of central India[J]. Chemosphere, 2011,82(7):941-946.

[27] 成莉，李琳，邢輝，等.XRCC1基因多態性與卵巢癌對鉑類藥物化療敏感性的相關性研究[J].臨床腫瘤學雜志，2014，19(4)：312-317.

[28] 魏嘉，張微，鄒征云，等.胃癌鉑類化療預后與XRCC1多態性關系[J].中國公共衛生，2007，23(7)：839-840.

[29] 黃朝暉，華東，李莉華，等.XRCC 1 Arg399Gln基因多態性對鉑類藥物化療胃癌患者預后的影響[J].腫瘤，2008，28(3)：242-245.

Correlation between XRCC1 gene Arg194Trp polymorphism and platinum-based chemotherapy in patients with gastric cancer

ZHONGLan1,HUANGTao,XIEXianhe,FUShengmiao,GAOYunsuo,WUHua,ZHONGPeijun

(1HainanGeneralHospital,Haikou570311,China)

Objective To explore the correlation between X-ray cross complementing repair gene 1 (XRCC1) gene Arg194Trp polymorphism and platinum-based chemotherapy in patients with gastric cancer. Methods Eighty patients with gastric cancer who underwent platinum-based chemotherapy were selected, and the XRCC1 genotypes were detected by multiplex PCR and ligase detection reaction (LDR). All patients were treated with oxaliplatin-based first-line chemotherapy. Accorded to the curative effect standard of gastric cancer treatment, the patients were divided into the platinum sensitive group and platinum resistance group, and the correlation between XRCC1 gene Arg194Trp polymorphism and platinum-based chemotherapy was analyzed. Results There were three kinds of genotypes in XRCC1 gene Arg194Trp: Arg/Arg, Arg/Trp, and Trp/Trp, their distribution frequencies were 42.5% (34/80), 50% (40/80), and 7.5% (6/80), respectively. The proportional distribution of the three genotypes met genetic equilibrium law of Hardy-Weiberg, and the experimental subjects were representative. There were no significant differences in sex, age, histological type, TNM stage, chemotherapy regimen in patients with Arg/Arg, Arg/Trp, and Trp/Trp genetypes (allP>0.05). In 80 patients, platinum drug sensitivity (CR+PR) was found in 39 patients (48.8%), and platinum drug resistance (SD+PD) in 41 patients (51.2%). The sensitivity of platinum drugs in patients with Arg/Trp and Trp/Trp genotypes was significantly higher than that in patients with Arg/Arg genotype (P<0.05), and there was no significant difference between Arg/Trp and Trp/Trp genotypes in patients (P>0.05). Conclusion The XRCC1 gene Arg194Trp is related with the sensitivity of platinum-based drugs in patients with gastric cancer, and the detection of Arg194Trp polymorphism can provide a basis for individual chemotherapy of gastric cancer.

gastric carcinoma; X-ray cross complementing repair gene 1; single nucleotide polymorphism; platinum resistance

海南省醫學科研立項課題(瓊衛[2012]PT-17)。

鐘蘭(1966-)，女，副主任技師，研究方向為臨床醫學檢驗。E-mail: zhonglan3144@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.002

R735.2

A

1002-266X(2017)08-0005-04

2016-11-21)