外周和門靜脈血中循環腫瘤細胞在胰腺癌診治中的研究現狀及應用前景

王洋，周家華

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 附屬中大醫院，江蘇 南京 210009)

外周和門靜脈血中循環腫瘤細胞在胰腺癌診治中的研究現狀及應用前景

王洋1，周家華2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 附屬中大醫院，江蘇 南京 210009)

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，早期診斷率及5年生存率低。目前胰腺癌循環腫瘤細胞檢測技術繁多，其靈敏度和特異性不盡相同，外周血和門靜脈血中循環腫瘤細胞數量及標志物表達對胰腺癌的診斷、預后具有提示作用。本文作者對外周和門靜脈血中循環腫瘤細胞在胰腺癌診治中的研究現狀作一綜述。

循環腫瘤細胞; 胰腺癌; 門靜脈血; 檢測; 預后； 綜述

目前胰腺癌(pancreatic carcinoma，PC)是惡性程度最高的腫瘤之一，在西方國家為第四大癌癥相關的主要死亡原因，其5年生存率僅為1%～4%，中位生存期為4～6個月[1]。盡管對無淋巴結侵犯的胰腺癌患者行外科手術切除可使其5年生存率提高至20%～25%，但大多數患者就診時已存在肝臟或腹腔轉移。腹部增強CT、磁共振等影像學檢查是目前唯一可行的診斷方法，但無法顯示<5 mm的微小病灶或轉移灶。腫瘤標志物包括CA19- 9、CEA等，其敏感性及特異性均有限[2]，僅具備一定參考價值。而近來出現的循環腫瘤DNA(ctDNA)、外泌體(exosome)等血清學指標仍處于實驗階段，尚未投入臨床應用。目前胰腺癌的早期診斷在技術上難以實現，但對腫瘤細胞的早期發現將有利于減緩腫瘤進展及病灶轉移，降低患者死亡率。大量研究[3- 6]證實,腫瘤細胞存在于胰腺癌患者的外周血及門脈系統中。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells， CTCs)是來源于原發腫瘤或轉移灶、獲得脫離細胞基底膜的能力并入侵通過組織基質進入血管的腫瘤細胞，其在腫瘤復發和轉移過程中的作用逐漸得到重視。隨著細胞檢測及鑒定技術的發展，對外周血及門靜脈中CTCs的檢測使胰腺癌的早期診斷、化療效果評估及預后判斷成為可能。現就近年來胰腺癌CTCs的檢測技術、研究現狀及應用前景進行綜述。

1 CTCs檢測技術

1.1 分離和富集

CTCs與循環血細胞相比數量極少，在10 ml外周血中可能僅存在1～2個，而在同樣體積血液中存在107的白細胞和超過1010的紅細胞。因此對CTCs的分離須過濾掉血液中其他細胞的干擾，特定地篩選出這些數量稀少的腫瘤細胞。

1.1.1 物理富集方法

物理富集方法是根據CTCs與血細胞間密度、直徑等物理性質不同而進行分離的方法，目前最常用的物理富集方法為密度梯度離心法及濾過膜分離法。

1.1.1.1 密度梯度離心法 密度梯度離心法是一種較為傳統的細胞富集技術，利用特定介質使不同密度的細胞在離心管內通過重力作用分層、分離，其常用介質為氯化銫、蔗糖等。CTCs較外周血單核細胞具有低密度特點，在此基礎上建立的OncoQuick系統較常規方法增加了多孔屏障，能使分離出的目的細胞更加純化，從而提高CTC的檢出率[7]，但仍有特異性低的缺點。

1.1.1.2 濾過膜分離法 ISET以及ScreenCell?過濾裝置根據細胞大小不同進行分揀，其濾孔直徑在8.0 mm或以下，已能夠從結腸癌、肝癌、軟組織肉瘤、非小細胞肺癌等惡性腫瘤中的外周血中分離出CTCs[8- 11]。其優勢在于能夠快速分離活細胞或固定細胞，不依賴于上皮標志物，已被證實其靈敏度高于單純利用上皮標志物抗體的檢測方法。該技術成本低廉，且分離過程中能保持細胞完整性，避免對細胞形態的破壞而影響進一步的細胞培養、細胞形態學及分子生物學分析。但其缺點仍為特異性不足，易致CTCs丟失或白細胞混入。

1.1.2 生物富集方法

生物富集方法是根據CTCs和血細胞間生物標志物的差異進行分離的方法。免疫磁珠分離法是最常用的生物富集方法，其利用特異性的單克隆標記磁珠結合腫瘤細胞表面特異性抗原(通常為epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)進行細胞分選。唯一被FDA認證的CellSearch系統現已應用于轉移性乳腺癌、結腸癌及前列腺癌的檢測和治療中，但對胰腺癌的檢測應用較少。該技術受限于在外周循環中存在非腫瘤的上皮細胞[12]，這種現象甚至已經在健康受試者體內得到證實，并且上皮標志物通常在腫瘤細胞發生上皮間質轉化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)過程中丟失，因此該法同樣存在假陽性和假陰性的缺陷。

1.2 檢測和鑒定

1.2.1 細胞計數

細胞計數法是根據細胞的抗原表達來分離和計數CTCs，大多使用抗上皮特異性抗原的抗體。其優點在于保證了CTCs完整性，能進一步分析其細胞形態學和分子學特征，而缺點在于缺乏腫瘤特異性抗體。

流式細胞術(flow cytometry，FCM)是通過單克隆抗體對腫瘤細胞特異性標志物的識別實現分選和計數，并且該技術可同時檢測CTCs多種生物學特性，包括細胞內DNA含量、細胞活力以及細胞內或表面特異標志物等，但其缺點是靈敏度偏低。Catenacci等[13- 14]使用FACS(fluorescence activated cell sorting)系統成功將胰十二指腸切除術中采集的門靜脈CTCs進行計數，證實其數量多于同時采集的外周血中CTCs。

1.2.2 免疫熒光染色

免疫熒光染色基于腫瘤相關抗原或特異性標志物與單克隆抗體結合,通過顯色反應來判斷目的細胞特性，常用標志物有EpCAM、CK、CA19- 9等。使用雙重免疫熒光染色還能夠證明兩種標志物在同一細胞中表達，并對其定位加以區分。該檢測方法較為簡便，且敏感性和特異性較高。但在一些良性上皮增殖性疾病、手術、炎癥和組織創傷等情況下，部分上皮細胞可進入外周血，這些細胞表面存在同樣的特異性抗原，易致假陽性發生；同時，在發生EMT過程中，部分CTCs表面特異性標志物表達減弱甚至丟失，導致假陰性的發生。Poruk等[15]通過對46例PDAC患者外周血CTCs的CK、Vimentin及CD45進行染色，將其分為上皮樣CTCs和間質樣CTCs，得出兩者數量分別與腫瘤總體生存期(overall survival,OS)及早期復發有關。基于該技術改進的iFish(immunostaining- fluorescence in situ hybridization)染色在胰腺癌、胃癌中也得到應用[16- 17]。

1.2.3 核酸檢測

逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase- polymerase chain reaction,RT- PCR)檢測腫瘤的過表達或突變基因的mRNA，相對于復雜的DNA檢測是一種很好的替代方法。腫瘤細胞死亡后，RNA在血液中快速降解，對其檢測可以代表腫瘤細胞的完整特性，而細胞碎片或游離RNA則不具備這一優勢。RT- PCR采用熒光探針與擴增序列特定寡核酸序列相結合，從而使擴增時出現假陽性的可能最小化，并可以同時對多種突變進行定量檢測。相對于免疫細胞化學(immunocytochemistry,ICC)來說，該方法更為客觀，并且更易實現自動化，RT- qPCR已逐漸應用于胰腺癌CTCs檢測中[18- 19]。

1.2.4 微流體芯片

微流體芯片技術(CTC- chip)是基于微流體學和免疫學的CTCs檢測技術，由Nagrath等[20]首先報道。芯片表層包被EpCAM抗體，當外周血樣本通過芯片時，EpCAM+細胞附著于微流體柱表面。通常將CK(cytokeratin)和DAPI(4′,6- diamidino- 2- phenylindole)作為陽性分選，CD45作為陰性分選，因此其敏感性和特異性均非常高。在其基礎上改進的人字形芯片(herringbone- chip，HBChip)，增加了目的細胞和芯片的交互數量，可以處理更大容量血液樣本，提高了腫瘤細胞的分離效率。Wen等[21]利用CMx系統將胰十二指腸切除術中采集的門靜脈血中符合panCK+/CD45-/DAPI+條件的細胞篩選出，并得出其數量與腫瘤肝轉移密切相關。

2 CTCs在胰腺癌中的應用

2.1 CTCs與胰腺癌診斷

CTCs作為生物標志物在胰腺癌中的作用與其他實體瘤中相似，其在外周血中數量稀少，大量腫瘤晚期患者檢測率仍偏低，而鮮有文獻報道其檢測假陽性，因此檢測特異性明顯優于敏感性。但如前所述，目前檢測方法繁多，對CTCs細胞定義也不盡相同，使得各方法間很難比較。

CTCs對于胰腺癌的診斷價值，各研究結論不一。Allard等[12]利用CellSearch系統在16例PDAC患者外周血中6例檢測出CTCs(37.5%)。Rhim等[22]使用GEM- chip法對32例胰腺病變患者外周血進行檢測，在11例PC患者中8例檢測出CTCs(73%)，21例囊性病變患者中7例檢測出CTCs(33%)，而在19例健康對照者中均未檢測出CTCs。Poruk等[15]利用ISET系統在44例可切除PDAC患者中40例檢測出CTCs(90%)，得到間質樣CTCs與患者術后短期復發相關(P=0.043)。Yang等[16]利用密度梯度離心及iFish法在25例PDAC患者中檢測出103個CTC細胞，而其數量與腫瘤分期及CA19- 9水平并無關聯。

CTCs對胰腺癌的診斷陽性率仍明顯低于超聲內鏡穿刺(endoscopic ultrasonography- fine needle aspiration,EUS- FNA)，但其特異度普遍在95%以上，與內鏡取得活檢病理結果相一致，進一步行分子生物學研究可提高其診斷準確性，并且其在費用以及安全性方面明顯優于超聲內鏡。因此,CTCs檢測可作為潛在的輔助檢查手段，在將來投入臨床應用。

2.2 CTCs與胰腺癌預后

現有眾多證據表明，CTCs的存在提示胰腺癌患者較差的預后。Kurihara等[23]利用CellSearch法在26例PC患者中11例檢測出CTCs(42%)，這部分患者具有較短的總體生存期(P<0.001)。Poruk等[15]利用ISET系統在44例可切除PDAC患者中40例檢測出CTCs(90%)，得到上皮樣CTCs與患者預后相關(P=0.008)。Yang等[16]利用密度梯度離心及iFish法在25例PDAC患者中檢測出103個CTCs，而CTC≥3·(7.5 ml)-1提示腫瘤較差預后(P=0.037)。

盡管有研究得出CTCs數量與胰腺癌預后無顯著性關聯，但結果仍提示存在這一趨勢，若將其較少樣本量納入考慮，則該結論的可信度將有所增加，因此仍須進行大樣本研究及長期跟蹤隨訪來提高其準確性。

2.3 CTCs與門靜脈系統

Jiao等[24]利用CellSearch系統對29例結直腸癌肝轉移患者肝切除術中獲取的7.5 ml門靜脈血CTCs進行計數，發現其中位數[87·(7.5 ml)-1]多于同時采集的外周靜脈血[1·(7.5 ml)-1]。Catenacci等[13]最近利用超聲內鏡及細針穿刺對18例胰腺膽管癌(PBCs)患者門靜脈血CTCs進行獲取和計數，同樣發現其中位數[111.8·(7.5 ml)-1]顯著多于同時采集的外周血[0.7·(7.5 ml)-1]，且在不可切除PBCs患者中數量多于可切除PBCs患者。

肝臟對消化道腫瘤CTCs具有過濾作用，使CTCs進入全身循環的數量明顯減少，其機制類似于肝臟對藥物的“首過消除”效應。胰十二指腸切除術中收集的門靜脈血CTCs數量與術后肝轉移相關，其陽性預測值達到84.6%，陰性預測值達到87.2%[21]，而外周血中CTCs的低檢測率限制了其提示作用。這一結論對門靜脈血高水平CTCs患者術后進行輔助治療具有指導意義。近來有學者嘗試將轉移起始細胞(metastasis- initiating cells,MICs)作為預后指標，然而其僅存在于具有高水平CTCs數量的血液中，于單個血液樣本中難以捕獲，且缺少特異性標志物，因此并沒有實際應用意義[21]。

Arnoletti等[14]對21例PDAC患者術前及術后外周血、術中腫瘤切除前后門靜脈血中CTCs性質進行比較，發現門靜脈血CTCs具有更高水平K- RASmutmRNA轉錄以及組蛋白乙酰化水平，且在腫瘤切除后進一步升高，預示著腫瘤切除后CTCs仍具有一定轉錄活性，且可以被M- MDSC(myeloid- derived suppressor cells with immature monocytic nature)所誘導的免疫抑制環境所增強。而在門靜脈血中CTCs數量也與M- MDSC水平密切相關，提示門靜脈的免疫抑制微環境對CTCs的免疫逃逸具有促進作用。門靜脈系統中存在的渦流對其內腫瘤細胞具有滯留作用，增加細胞和細胞間、細胞和血管間物質交換，促進腫瘤細胞活化和其在局部組織中的駐留。這也解釋了門靜脈相對于外周血中CTCs的特殊性。

在胰腺癌手術當中對門靜脈血的獲取將有利于檢測其中活化且具有轉移潛能的腫瘤細胞，而這項技術也將隨著超聲內鏡的應用得到進一步推廣。

3 結 語

就目前胰腺癌的早期診斷和轉移監測而言，CTCs(尤其門靜脈CTCs)具有重要意義，利用循環血CTC實時檢測來代替腫瘤組織活檢，將能極大程度改善患者治療的適應性及減少創傷，避免不必要的有創性檢查及過度治療。此外，有研究證實CTCs可通過一種“腫瘤自身種植”機制完全復制原發腫瘤的特性，在浸潤血管中自由出入，即能夠從血液中重新返回原位灶繼續生長引起腫瘤復發，并促進血管形成及基質募集[25]。而在部分PDAC癌前病變模型中，CTC檢測可在腫瘤形成之前即呈現陽性，因此其釋放入血可認為是發生在腫瘤形成中的早期事件，這也支持了CTCs檢測能夠用于監測胰腺癌進展的觀點。進一步行癌細胞特異性基因突變研究，在未來可能實現以CTCs為目標的靶向治療。相較乳腺癌、肺癌、結腸癌等其他上皮腫瘤來說，胰腺癌仍然缺乏特異性足夠高的腫瘤標志物，且CTCs檢測率相對較低，檢測成本相對較高，目前尚缺少大規模、前瞻性研究來指導其臨床應用。胰腺癌術中采集的門靜脈血CTCs相較外周血檢測率明顯升高，且對胰腺癌轉移具有提示作用，在超聲內鏡進一步推廣后其安全性及實用性將大為提高。

總而言之，作為新興的“液體活檢”項目，CTCs檢測對于腫瘤的無創實時監測、個體化治療或將大有助益，個體化用藥也將更多依賴于CTCs而非腫瘤活檢組織的細胞學及分子生物學分析。

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2017- 01- 27

2017- 05- 20

江蘇省重點研發計劃項目(7790000085)

王洋(1991-)，男，江蘇南京人，在讀碩士研究生。E- mail:840238489@qq.com

周家華 E- mail:zhoujh@seu.edu.cn

王洋,周家華.外周和門靜脈血中循環腫瘤細胞在胰腺癌診治中的研究現狀及應用前景[J].東南大學學報：醫學版，2017，36(4)：673- 677.

R44; R735.9

A

1671- 6264(2017)04- 0673- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.037