裸小鼠胃癌原位移植模型的建立

田樹紅，王日超，肖 敏，符 健

(海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物安全性評價研究中心，海南 ?？?571199)

研究報告

裸小鼠胃癌原位移植模型的建立

田樹紅，王日超，肖 敏，符 健

(海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物安全性評價研究中心，海南 ?？?571199)

目的 建立一種新的裸小鼠胃癌原位移植模型。方法 采用Matrx VIP 3000型氣體麻醉系統(tǒng)對實(shí)驗動物進(jìn)行麻醉。分別用“包埋法”、“掛線法”、和“胃囊法”建立BALB/c裸小鼠胃癌原位移植瘤模型。術(shù)后用Caliper IVIS Kinetic小動物活體成像系統(tǒng)對實(shí)體瘤的生長情況進(jìn)行檢測和分析。術(shù)后28 d對腫瘤組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 采用包埋法建立胃癌原位移植裸小鼠模型，除了與其它常用方法一樣具有高移植成功率以外，還具有操作簡便、時間短、難度低、腫瘤組織不易與其它組織直接接觸等特點(diǎn)。結(jié)論 包埋法能快速制備大批量小鼠胃癌原位移植模型，為胃癌原位移植模型相關(guān)研究提供便利。

胃癌；原位移植；小動物活體成像；氣體麻醉

胃癌是常見的消化道癌癥之一，在世界癌癥致死病例中位列第2，僅次于肺癌，抗胃癌藥物的研發(fā)也越來越受到重視。荷瘤動物模型的建立是抗癌藥物研發(fā)必不可少的條件。常見的胃癌移植模型按接種部位可分為皮下移植和原位移植，按接種類型又可分為細(xì)胞混懸液法和腫瘤組織塊法。常見的腫瘤組織塊胃癌原位移植模型的建立方法有“掛線法”、“胃囊法”和“OB法”[1,2]。本研究建立了一種新的BALB/c裸小鼠胃癌原位移植模型，即包埋法，可快速制備大批量小鼠胃癌原位移植模型，為胃癌原位移植模型相關(guān)研究提供便利。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物、飼料與分組：SPF級BALB/c裸小鼠，5～6周齡，雄性，體重(18～22)g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。實(shí)驗地點(diǎn)為海南省藥物安全性評價研究中心，實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK(瓊)2012-0013。實(shí)驗動物飼料購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心，合格證號№：44200300005682。 6只裸小鼠用于皮下移植模型的建立，24只裸小鼠用于胃癌原位移植模型的建立，分為掛線法、胃囊法和包埋法3個組，每組8只。

1.1.2 腫瘤細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，并委托上海樂晨生物科技有限公司對細(xì)胞株進(jìn)行生物發(fā)光標(biāo)記。

1.1.3 實(shí)驗試劑及主要儀器：試劑：異氟烷(瑞沃德)，生物發(fā)光檢測底物D-熒光素鉀鹽(Synchem)，PBS緩沖液、RPMI 1640培養(yǎng)液和胰酶消化液(Gibco)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；主要儀器：Kinetic小動物活體成像系統(tǒng)(Caliper)；VIP 3000型氣體麻醉系統(tǒng)(Matrx)；BX41顯微鏡系統(tǒng)(奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌皮下移植瘤模型的建立：術(shù)前和手術(shù)過程中均使用Matrx VIP 3000型氣體麻醉系統(tǒng)對動物進(jìn)行麻醉，麻醉劑為異氟烷。將體外培養(yǎng)好的人胃癌細(xì)胞SGC-7901用無菌PBS緩沖液制備成濃度為1×107個細(xì)胞/mL混懸液備用。取0.2 mL該細(xì)胞混懸液，接種于6只裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，待成瘤后備用。

1.2.2 胃癌原位移植瘤模型的建立：動物術(shù)前禁食12 h，術(shù)前和手術(shù)過程中均使用Matrx VIP 3000型氣體麻醉系統(tǒng)對動物進(jìn)行麻醉，麻醉劑為異氟烷。取30只檢疫合格的SPF級BALB/c裸小鼠，按體重序隨機(jī)分為掛線法、胃囊法和包埋法3個組，每組8只。取生長良好的皮下移植瘤(色澤紅潤、皮膚無損傷、腫瘤無破損)，制備成體積約為2 mm3的腫瘤組織塊備用。麻醉動物取仰臥位，安爾碘消毒手術(shù)部位及周邊皮膚，劍突下方約5 mm處沿腹中線左側(cè)橫向逐層剪開皮膚，開口長度約為1 cm，用小彎捏輕輕將胃拉出準(zhǔn)備接種腫瘤組織塊。掛線法和胃囊法操作步驟參照相應(yīng)參考文獻(xiàn)。包埋法操作步驟如下：用1 mL一次性無菌注射器往動物胃漿膜層輕輕注入0.1 mL 0.9%(g/mL)氯化鈉注射液，使?jié){膜層形成一個小皮丘，然后用小鑷子輕輕捏住皮丘一側(cè)邊緣，用眼科剪剪一個約3 mm長的小口，再用小鑷子將腫瘤塊送入皮丘內(nèi)即可。這樣腫瘤組織不會與其它組織黏連，對胃的損傷也較小。最后逐層縫合好腹腔，安爾碘消毒創(chuàng)口，小心飼養(yǎng)。

1.2.3 荷瘤裸小鼠胃癌原位移植腫瘤生長情況的檢測：采用美國Caliper IVIV Kinetic小動物活體成像系統(tǒng)檢測荷瘤裸小鼠體內(nèi)原位移植瘤的生長情況。小動物活體成像系統(tǒng)是目前原位癌檢測最有效的技術(shù)，動物體內(nèi)的腫瘤灶只要有數(shù)十個腫瘤細(xì)胞就能被檢測到。檢測前5～10 min按0.1 mL/10 g體重腹腔注射30 mg/mL的底物D-熒光素鉀鹽。

1.2.4 荷瘤裸小鼠胃癌原位移植腫瘤組織病理檢查：裸小鼠胃癌原位移植模型建立4周時，CO2處死動物，剖檢取出胃及腫瘤組織，4%(v/v)甲醛溶液固定，修塊、脫水、浸蠟、包埋、切片，H.E染色，鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 裸小鼠胃癌原位移植模型的建立

分別采用掛線法、胃囊法和包埋法建立裸小鼠胃癌原位移植模型，成瘤率均為100%，手術(shù)過程中動物死亡率均為0。比較這3種方法，掛線法和包埋法手術(shù)時間最短，胃囊法用時最長，分別為(4.8±0.41)min(與胃囊法比較，P<0.01)、(4.7±0.53)min(與胃囊法比較，P<0.01)和(8.3±0.66)min。

2.2 小動物活體成像系統(tǒng)檢測荷瘤動物體內(nèi)腫瘤的生長情況

建立小鼠胃癌原位移植模型后，用小動物活體成像系統(tǒng)對動物體內(nèi)腫瘤生長情況進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，檢測結(jié)果見圖1。植入荷瘤動物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞只有存活的才能被檢測到。結(jié)果表明，用包埋法建立的BALB/c裸小鼠胃癌原位移植模型與常用的掛線法和胃囊法比較，腫瘤生長良好，不易發(fā)生腫瘤廣泛種植現(xiàn)象。圖1中A、B、C分別為包埋法、胃囊法和掛線法建立的胃癌原位移植模型。其中，采用掛線法建立的胃癌原位移植模型中，有50%(4/8只)的動物腫瘤已經(jīng)發(fā)生腫瘤廣泛種植現(xiàn)象。實(shí)驗各組的實(shí)體瘤見圖2。

2.3 常用方法和新方法建立小鼠肝癌原位移植瘤病理檢查

BX41顯微鏡系統(tǒng)100倍光鏡下觀察腫瘤組織標(biāo)本，結(jié)果表明，掛線法、胃囊法和包埋法建立的裸小鼠胃癌原位移植瘤腫瘤細(xì)胞及組織生長良好，未出現(xiàn)壞死，細(xì)胞形態(tài)一致，癌細(xì)胞成癌巢狀分布，癌巢周圍為纖維結(jié)締組織(圖3)。

注：(A)包埋法；(B)胃囊法模型；(C)掛線法模型。圖1 胃癌原位移植瘤生物發(fā)光檢測結(jié)果Note.(A)Embedding method; (B) Gastric bursa method.(C)Thread-ligation method. Fig.1 The images of orthotopic transplantation tumors tested by IVIS Imaging Systems

注：(A)包埋法；(B)胃囊法模型；(C)掛線法模型。圖2 原位癌實(shí)體瘤Note.(A)Embedding method; (B)Gastric bursa method.(C)Thread-ligation method.Fig.2 Gross appearance of the orthotopic gastric carcinomas

注：(A)包埋法；(B)胃囊法模型；(C)掛線法模型。圖3 胃癌原位實(shí)體瘤病理檢查照片(HE染色，×100)Note.(A)Embedding method; (B) Gastric bursa method(C)Thread-ligation method.Fig.3 Histological appearance of the solid tumors(HE staining，×100)

3 討論

在進(jìn)行原位移植手術(shù)時，實(shí)驗動物一般采用注射類麻醉劑進(jìn)行麻醉，如戊巴比妥鈉、氯胺酮和水合氯醛等。但這些麻醉劑的麻醉時間較長(1～3)h，在麻醉過程中易出現(xiàn)動物麻醉不深或麻醉死亡等現(xiàn)象。因此，在手術(shù)過程中，我們采用通過VIP 3000型氣體麻醉系統(tǒng)(Matrx)改造的新裝置對動物進(jìn)行持續(xù)氣體麻醉。采用這種方法對動物進(jìn)行麻醉時，動物不易發(fā)生麻醉死亡，而且動物在術(shù)后10 min以內(nèi)就能自主活動，避免由于麻醉時間較長引起動物體溫過低而造成術(shù)后死亡。

在胃癌原位移植方法中，掛線法是用手術(shù)線將腫瘤組織塊直接縫掛在漿膜損傷的胃壁上[3]；胃囊法是先采用荷包縫合法制備胃黏膜小胃囊，再將腫瘤組織塊放入其中[4-6]；OB法是用醫(yī)用生物膠將腫瘤組織粘貼于損傷的胃大彎漿肌層上[6-8]。在掛線法和OB法中，腫瘤組織容易向腹腔生長且會與其它組織發(fā)生粘連；胃囊法操作難度大，由于小鼠胃壁較薄，容易刺穿胃壁造成胃穿孔并引起動物死亡。因此，本研究建立了一種新的BALB/c裸小鼠胃癌原位移植模型，即包埋法。該方法具有移植成功率高(100%)，操作簡便、時間短、難度低、腫瘤組織不易與其它組織直接接觸等特點(diǎn)。

此外，無論是采用哪種胃癌原位移植方法，在制備腫瘤塊時，要用氯化鈉注射液或緩沖液將切好的腫瘤組織塊多漂洗幾次，以避免組織塊表面易脫落的腫瘤細(xì)胞掉到腹腔內(nèi)或手術(shù)切口處造成腫瘤的廣泛種植。在通常的胃癌原位移植模型方法中，OB膠法與掛線法較為類似，腫瘤塊均直接暴露在腹腔內(nèi)，溶液與其它組織發(fā)生黏連。胃囊法雖然能避免腫瘤組織塊與其它組織發(fā)生黏連，但操作難度較大，且容易對胃黏膜造成較大損傷及胃穿孔。包埋法則有效避免了這些情況的發(fā)生，為實(shí)現(xiàn)快速制備大批量胃癌原位移植模型提供了有力保障。

[1] Zhou GX，Gao C，Xu P，etal．Replication Methodology of Animal Models for Human Disease [M]． Shanghai：Shanghai Scientific and Technical Publishers，2008．

[2] 王輝，吳潔，花寶金，等．人胃癌免疫缺陷小鼠移植瘤轉(zhuǎn)移模型研究進(jìn)展[J]．北京中醫(yī)藥，2012，31(3): 237-240.

[3] 戴小軍，張曉春，孫衛(wèi)東，等．VRIN治療后人胃癌裸鼠原位移植瘤活體成像觀察 [J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)2014，35(2): 11-14.

[4] 汪芳裕, 朱人敏, 王 琳, 等．建立裸小鼠人胃癌原位移植模型的一種新方法[J]．腫瘤防治研究, 1998, 52(1): 15-16.

[5] 汪芳裕, 朱人敏, 王琳. 原位移植建立裸小鼠人胃癌轉(zhuǎn)移模型 [J]. 南京部隊醫(yī)藥, 1997, 5: 25-26.

[6] 陳亞琳, 魏品康, 許玲, 等. 采用OB膠粘貼法建立人胃癌裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型 [J]．癌癥, 2005, 24(2): 246-248.

[7] 范立僑, 李勇, 馮峰, 等. 抑制鋅指蛋白 139 對胃癌原位移植裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 [J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2015, 36(3): 353-356.

[8] 葉敏, 孫大志, 修麗娟, 等. 痰散結(jié)方對 MKN-45 人胃癌裸鼠原位移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 [J]．中國中醫(yī)藥信息雜志, 2015, 22(9): 60-62.

Establishment of an orthotopic gastric cancer model in nude mice

TIAN Shu-hong，WANG Ri-chao，XIAO Min，F(xiàn)U Jian

(Hainan Research Center for Drug Safety Evaluation, Hainan Medical College, Haikou 571199，China)

Objective To establish a new orthotopic gastric cancer model in nude mice. Methods The BALB/c nude mice were anesthesized by Matrx VIP 3000 type gas anesthesia systems. Orthotopic gastric cancer models were established by embedding method, thread-ligation method or gastric bursa method in the nude mice. The tumor growth after transplantation in living body was detected by a Caliper IVIS Kinetic small animal imaging system. Samples of the transplanted tumor tissues for histological examination were taken at 28 days after transplantation. Results The orthotopic gastric cancer model was successfully established by embedding method. Compared with the models prepared by other commonly used methods, it showed obvious advantages such as a high success rate of transplantation, simple operation, short time, less difficulty, and less direct contact of the implanted tumor tissue with other organs, etc. Conclusions Large amount of mouse models of orthotopic gastric cancer can be prepared rapidly by the embedding method, thus, provide a convenient tool for related research of gastric cancer in future.

Gastric Cancer; Orthotopic transplantation；Fluorescence imaging, in vivo; Model, nude mice

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO 81160408)。

田樹紅(1980-)，男，助理研究員，碩士，研究方向：藥理毒理學(xué)。E-mail： 18089862900@163.com。

符健，(1960-)，男，博士，教授，研究方向：藥理毒理學(xué)，E-mail： Fujian.hnmc@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0021-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.004

2016-06-20