LINGO-1在脊髓神經干細胞向少突膠質細胞分化中的作用研究

趙晨光，許剛，琚芬，孫瑋，袁華，牟翔

LRR結構和免疫球蛋白結構域Nogo受體作用蛋白(LRR and Ig Domain Containing，Nogo Receptor Interacting Protein，LINGO-1)是髓鞘源性抑制因子(Myelin-Associated Inhibitory Factors，MAIFs)復合受體中最為重要的組成部分之一[1]。當脊髓損傷后，Nogo-A、髓磷脂相關糖蛋白(Myelin Associated Glycoprotein，MAG)等髓鞘源性抑制因子大量釋放，并通過與NgR/P75/LINGO-1或NgR/P75/LINGO-1復合受體結合來介導多種生物效應，在脊髓損傷后的神經修復中扮演了極其重要的角色[2]。LINGO-1是由614個氨基酸構成的跨膜生物蛋白，由15號染色體編碼而成，定位于15q24.3，其可以通過調控RhoA途徑，終使生長錐塌陷而使軸突再生受阻[3]；也可以參與并下調表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)，從而影響Akt通路而調控神經元存活[4]。瑞典Frisen小組研究證實在小鼠室管膜區存在著“靜止”狀態的神經干細胞(Neural Stem Cells, NSCs)，在脊髓損傷等特定因素下被激活從而出現增殖進而分化的現象[5]，本研究旨在觀察LINGO-1調控脊髓神經干細胞(Spinal Cord Derived Neural Stem Cells，SpNSCs)向少突膠質細胞分化及成熟的生物學作用，為進一步調控其促進脊髓損傷后神經修復帶來新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗用Fisher344(10周齡)大鼠(160～180g)由第四軍醫大學實驗動物中心提供，共3只，進行3次生物學試驗重復。細胞培養用DMEM/F12、B27添加劑、N2添加劑、GlutaMAX添加劑及胎牛血清等均為Gibco公司產品；bFGF和EGF購于Peprotech公司，Accutase、Poly-L-Lysine及Laminin購于Sigma公司；LINGO-1、A2B5、O4、髓鞘堿性蛋白(Anti-Myelin Basic Protein，MBP)，熒光二抗FITC-conjugated Goat anti-mouse，FITC-conjugated Goat anti-rabbit及Texas Red-conjugated Goat anti-mouse IgG購自STEMCELL公司。

1.2 方法 ①成年大鼠SpNSCs的分離培養：生長10周Fischer344大鼠處死后，椎板減壓暴露脊髓，取C3至T12節段脊髓置于預冷的Hanks液中，小心用眼科剪剝離硬脊膜，將脊髓剪碎后加入Accutase中于37°C中消化30 min，加入NSCs培養基終止消化，離心后用NSCs培養基重懸，用火焰拋光的巴斯德吸管反復吹打成單細胞懸液并用40μm濾網過濾后，胎盤藍計數，按105/ml密度植于NSCs培養基(DMEM/F12+2%B27+1%N2+20ng/ml EGF+20ng/mlbFGF)中，每3天半量換液一次。生長至第7天時機械吹打法傳代處理。每7天傳代，大于3代后進行實驗。② LINGO-1 shRNA慢病毒表達載體構建及包裝由上海吉凱生物基因公司提供。體外培養的大鼠脊髓來源神經干細胞分為對照組及干擾組，干擾組通過LINGO-1 shRNA慢病毒感染SpNSCs下調LINGO-1表達，對照組表達Scramble-shRNA的慢病毒，shRNA插入序列為：Sense5`-TGCTGTAGTCTAGCAGGA-TGACGATCGTTTTGGCCACTGACTGACGATC-GTCACTGCTAGACTA-3 `， Antisense 5 `-CCTG-TAGTCTAGCAGTGACGATCGTCAGTCAGTGG-CCAAAACGATCGTCATCCTGCTAGACTAC-3`。③免疫熒光染色：吸棄培養基用PBS清洗1次以徹底去除殘留的培養基，4%多聚甲醛固定30min后用PBS清洗3次，每次5min；加入0.3%Triton X-100通透5min，PBS清洗2次。加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，次日吸棄一抗，PBS洗3次，每次5min。加入稀釋好的熒光二抗37℃避光孵育2h，PBS洗3次，每次5min，之后滴加DAPI封片劑，室溫孵育30min。鏡下觀察熒光染色的少突膠質細胞形態及數量，并使用Image-Pro Plus 5.0軟件進行測量分析A2B5、O4陽性細胞和LINGO-1雙染陽性細胞比例。④Westernblot蛋白定量檢測：分別在分化第7天取蛋白，吸棄培養液，用預冷的PBS清洗2次，以徹底去除殘留的培養液。加入預冷的RIPA裂解細胞并轉移入預冷的離心管中，離心后將上清轉移至預冷的離心管中，用BCA對提取的蛋白進行定量。取蛋白樣品，加入蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE分離蛋白，濕轉法將蛋白質轉移至PVDF膜上。將PVDF膜轉移至含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉1h，加入一抗的稀釋液，4℃過夜，次日TBST洗膜3次，每次10min。將PVDF膜放入含稀釋二抗的10cm皿中，孵育1h，在增強化學發光反應混合液中反應2～3min后，拍片顯影，條帶灰度采用Imege J軟件進行分析MBP蛋白的相對灰度比值。

2 結果

2.1 LINGO-1在少突膠質細胞分化過程中表達情況

分別采用少突膠質細胞標志物A2B5及O4和LINGO-1抗體進行雙染色。結果表明在誘導分化后，部分脊髓神經干細胞向少突膠質細胞分化，細胞有雙極或三極突起，胞體較規則。LINGO-1抗體(圖1B、F)和A2B5抗體(圖1A)、O4抗體(圖1E)以及細胞核Hoechst染色(圖C、G)顯示分別共表達于培養分化細胞中(圖1D、H)，說明LINGO-1在脊髓神經干細胞分化成為少突膠質細胞的過程中持續表達。

2.2 LINGO-1促進少突膠質細胞分化成熟 為了進一步了解LINGO-1對少突膠質細胞分化成熟的影響，我們在分化第7天應用O4抗體對神經元進行免疫熒光染色。結果提示LINGO-1干擾組的少突膠質細胞(圖2D-F)比對照組(圖2A-C)的數量更多，成熟度更高，主要表現在LINGO-1干擾組少突膠質細胞分化更為徹底，細胞突起更長，并且有更多的片狀髓鞘結構。定量分析成熟少突膠質細胞比例顯示對照組為5.3%，而LINGO-1干擾組則高達17.4%，是對照組細胞的3.28倍，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 LINGO-1對MBP蛋白表達的影響 相比對照組，LINGO-1干擾組的MBP表達量明顯升高(圖3)，MBP條帶采用Image J軟件進行灰度值分析比較，轉化為數值進行量倍比較，進一步半定量分析顯示LINGO-1干擾組的MBP表達量為對照組的5.31倍(56.8±3.3、0.7±0.5，P<0.05)。

A.A2B5 B.LINGO-1 C.Hoechst D.Merge

E.O4 F.LINGO-1 G.Hoechst H.Merge

圖1LINGO-1在少突膠質細胞分化過程中表達情況。LINGO-1抗體(B,F)與A2B5抗體(A)、O4抗體(E)以及細胞核Hoechst染色(圖C、G)共表達在培養細胞中(D,H)(×40)。

A.O4 B.Hoechst C.Merge

D.O4 E.Hoechst F.Merge

圖2LINGO-1對少突膠質細胞分化成熟的影響：熒光倒置顯微鏡下觀察LINGO-1干擾組(D-F)和對照組(A-C)少突膠質細胞的成熟狀況，綠色細胞表示O4陽性細胞(×40)。

圖3 LINGO-1對MBP蛋白表達的影響

3 討論

本實驗中成功從成年大鼠脊髓中提取培養了神經干細胞，誘導分化后利用免疫熒光染色發現LINGO-1分別與A2B5及O4共表達，證實LINGO-1表達于少突膠質細胞成熟的各階段。然后利用RNAi對LINGO-1的表達進行下調，發現下調LINGO-1的表達可以促進脊髓神經干細胞向少突膠質細胞分化，并同時促進其成熟，進一步檢測成熟少突膠質細胞表達的MBP蛋白時也發現LINGO-1干擾組MBP蛋白表達量明顯高于對照組。以上實驗結果為脊髓損傷后早期干預促進內源性脊髓神經干細胞向少突膠質細胞分化并促進其成熟提供活體體外證據，也為進一步促進脊髓損傷后神經修復帶來希望。

脊髓損傷后大量神經元壞死、神經傳導束崩解，少突膠質細胞包裹軸突形成的髓鞘分解，形成大量的髓鞘源性抑制因子(Myelin-Associated Inhibitory Factors，MAIFs)，這其中包括Nogo-A、MAG和OMgp為代表抑制因子，其中Nogo-A通過其復合受體之一LINGO-1(LRR and Ig Domain Containing，Nogo Receptor Interacting Protein)介導了多種生物學效應，這包括阻止軸突再生及影響神經元存活[6-7]。脊髓損傷后位于中央水管周圍的具有多種分化潛能的神經干細胞被激活，但是大部分卻分化成為星形膠質細胞，所以如何調控其分化便成為目前神經修復研究的熱點問題。

本實驗中我們發現分離培養的脊髓神經干細胞經誘導分化后，LINGO-1分別與少突膠質細胞標志物A2B5及O4共表達于分化細胞中。A2B5及O4同為少突膠質細胞特異性標志物，但是二者的表達時間卻不盡相同[8]。A2B5在少突膠質細胞的早期表達，即在少突膠質-2型星形膠質細胞(Oligodendrocyte-Type2 Astrocyte Progenitor，O-2A Progenitor)及成少突膠質細胞中表達，而O4的表達則較為靠后，分別在成少突膠質細胞、未成熟少突膠質細胞及成熟少突膠質細胞中表達。本實驗中發現LINGO-1可以分別與以上2個標志物分別共表達，這說明LINGO-1在由脊髓神經干細胞分化為成熟少突膠質細胞的整個過程中持續表達，也提示其可能會在這一過程中持續發揮重要作用。

為了驗證LINGO-1對少突膠質細胞分化的作用，我們進一步下調LINGO-1的表達，結果發現干預后少突膠質細胞分化成熟比例有明顯提高，達到17.4%，是對照組的3倍之多。此外LINGO-1干擾組的少突膠質細胞還表現為細胞突起更長，并且有更多的片狀髓鞘結構。L??v[9]也檢測過LINGO-1對皮層來源NSCs向少突膠質細胞分化的影響，其發現下調LINGO-1后，少突膠質細胞分化成熟有輕微的升高，但是并無統計學意義，這可能與不同來源的NSCs的本身特性有一定關系。

MBP蛋白是成熟少突膠質細胞中表達的蛋白，是構成髓鞘的主要成分之一，其表達量的多少可以間接反映出少突膠質細胞的成熟情況，試驗中LINGO-1干擾組的MBP表達量明顯升高，為對照組的5倍之多，這與前面的實驗結果是一致的，都反應出LINGO-1對NSCs向少突膠質細胞分化成熟的負性調控作用。

本研究沒有進一步檢測LINGO-1影響少突膠質細胞成熟后對軸突成髓鞘作用的影響及分化成熟可能涉及的通路，這也是本研究下一步所努力的方向。明確LINGO-1在脊髓NSCs分化過程中在少突膠質細胞中的表達特征及其對少突膠質細胞分化成熟的影響可以使我們更加廣泛的了解LINGO-1的生物學功能，也為進一步促進脊髓損傷后神經修復提供可能的作用靶點，為治療脊髓損傷帶來更多的希望。

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