萬(wàn)古霉素軟膏劑的制備及效果評(píng)價(jià)

郭善軍　張曉林　曾吉祥

摘 要 制備出具有良好抑菌效果的萬(wàn)古霉素軟膏，并初步評(píng)價(jià)其透皮釋放性能。采用乳化法制備O/W型和W/O型兩種萬(wàn)古霉素軟膏。通過(guò)比較這兩種軟膏的物理性狀、體外透皮釋放率、體外抑菌、動(dòng)物藥效學(xué)等質(zhì)量評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定更優(yōu)的軟膏劑制備處方并初步建立萬(wàn)古霉素軟膏劑透皮實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，O/W型萬(wàn)古霉素軟膏的制備工藝簡(jiǎn)單，制劑穩(wěn)定性好，抑菌效果快速?gòu)?qiáng)效。

關(guān)鍵詞 萬(wàn)古霉素 軟膏劑 透皮制劑 生物被膜

中圖分類號(hào)：R681.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

萬(wàn)古霉素是一種糖肽類抗生素，臨床上主要用于治療由其他抗生素不敏感的革蘭氏陽(yáng)性菌所引起的嚴(yán)重感染，如肺炎等。隨著抗生素的亂用，導(dǎo)致細(xì)菌感染的疾病增多，終止最為抗生素最后一道防線的萬(wàn)古霉素的臨床使用增加，為了更好地指導(dǎo)臨床用藥，有必要對(duì)萬(wàn)古霉素軟膏劑進(jìn)行研究。

1材料

2000高效液相色譜儀（日本日立公司），RYJ-6B 藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司），AB135-S 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），XK97-A 菌落計(jì)數(shù)器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市齊欣科學(xué)儀器有限公司），SW-CJ-TD 無(wú)菌操作臺(tái)（蘇州凈化有限公司），S-3000N 掃描電鏡（HITACHI）。萬(wàn)古霉素（大連美倫生物技術(shù)有限公司），十八醇、丙二醇、白凡士林、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、十二烷基磺酸鈉、液狀石蠟均為藥用級(jí)。

2方法

2.1處方的組成

根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)和單因素實(shí)驗(yàn)篩選出了W/O型和O/W型2個(gè)最優(yōu)處方。W/O型處方：?jiǎn)斡仓岣视王?5g，硬脂酸5.0g，白凡士林15g，液狀石蠟14g，氫氧化鈣的飽和水溶液50g，萬(wàn)古霉素1.0 g。O/W型處方：十二烷基硫酸鈉1.5g，白凡士林17g，丙二醇10g，水50g，十八醇20g，氯化鈣0.5g，萬(wàn)古霉素1.0g。

2.2軟膏劑制備

2.2.1 O/W型軟膏劑的制備

稱取處方標(biāo)識(shí)量中的十八醇、丙二醇、白凡士林，在70℃的水浴下加熱融化為油相，稱取處方標(biāo)識(shí)量的氯化鈣、萬(wàn)古霉素、水，在70℃的水浴下加熱融化為水相。然后再劇烈攪拌，將水相緩緩傾入油相中，使其成軟膏狀，即得到O/W型萬(wàn)古霉素軟膏劑。

2.2.2 O/W型軟膏基質(zhì)的制備

按2.2.1中方法進(jìn)行制作，只是不加主要萬(wàn)古霉素。

2.2.3 W/O型軟膏劑的制備

稱取處方中標(biāo)識(shí)量的單硬脂酸甘油酯、液狀石蠟、硬脂酸、白凡士林，在70℃的水浴中加熱融化為油相，稱取處方標(biāo)識(shí)量的萬(wàn)古霉素、氫氧化鈣的飽和水溶液，在70℃的水浴中加熱融化為水相。在劇烈攪拌下，將水相緩緩傾入油相中，使其成軟膏狀，即得到W/O型萬(wàn)古霉素軟膏劑。

2.2.4 W/O型軟膏基質(zhì)的制備

按2.2.3中方法進(jìn)行制作，只是不加主要萬(wàn)古霉素。

2.3質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1性狀觀察

對(duì)兩種軟膏劑的顏色及外觀形態(tài)進(jìn)行觀察。

2.3.2穩(wěn)定性考察

（1）耐熱耐寒實(shí)驗(yàn)。分別取適量的W/O型和O/W型軟膏劑，在55℃的恒溫水浴中保存24h，取出后放至室溫，再在-20℃下放置24h，最后取出樣品，觀察樣品有無(wú)液化、變色、分層、粗化等現(xiàn)象。

（2）高速離心實(shí)驗(yàn)。分別稱取適量的W/O型和O/W型軟膏，在4000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心30 min，觀察有無(wú)分層、液化等現(xiàn)象。

2.4體外透皮釋放量測(cè)定

2.4.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取萬(wàn)古霉素2.02mg于容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL，搖勻，作為儲(chǔ)備液。紫外分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描確定萬(wàn)古霉素的最大吸收波長(zhǎng)為236nm，以236nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

（1）液相色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（150mm€？.6mm，5 m）；流動(dòng)相是乙腈-0.05mol/L磷酸銨緩沖鹽（8∶92）；檢測(cè)波長(zhǎng)236nm；流速1mL·min-1；最低檢測(cè)限0.8ng 。

（2）線性回歸方程的確定

精密配制濃度分別為3.1625 g·mL-1、6.325 g·mL-1、12.65 g·mL-1、25.3 g·mL-1、50.6 g·mL-1、101.2 g·mL-1、202.4 g·mL-1的萬(wàn)古霉素溶液，以236nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，每次進(jìn)樣量10 L，將濃度與峰面積進(jìn)行回歸即可得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）回收率實(shí)驗(yàn)

稱取適量萬(wàn)古霉素，配制濃度分別為5.0 g·mL-1、50 g·mL-1、150 g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將三種不同濃度的萬(wàn)古霉素溶液各分為兩份，分別在每份中加入W/O型和O/W型基質(zhì)，在70℃水浴中使基質(zhì)全部融化，混勻，離心，用0.22 nm的慮膜過(guò)濾，經(jīng)HPLC分離后在236nm處檢測(cè)，計(jì)算其回收率。

2.4.2離體鼠皮的準(zhǔn)備

2.4.3透皮實(shí)驗(yàn)方法

配制一定量的生理鹽水作為釋放液。接收池中灌入6.5mL的生理鹽水，讓液面與接收池瓶口齊平。再在接收池瓶口蓋上離體鼠皮（皮膚的角質(zhì)層朝外），將釋放池蓋在離體皮膚上，最后用夾子將釋放池、接收池、離體皮膚固定。把透皮釋放裝置放于37℃透皮實(shí)驗(yàn)擴(kuò)散儀中，待接收池中溫度也維持在37℃時(shí)，分別將適量的W/O和O/W兩種軟膏均勻的涂抹在離體皮膚上，轉(zhuǎn)速設(shè)為300 r/min。分別在第0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h等不同時(shí)間點(diǎn)取樣，取樣量為100 L，取樣后向接收池中加入等量 37℃生理鹽水。將取得的樣品經(jīng)離心、0.22nm微孔濾膜過(guò)濾，最后在HPLC上檢測(cè)樣品中萬(wàn)古霉素的濃度。

2.5軟膏劑體外抑菌效果試驗(yàn)

2.5.1藥皿抑菌試驗(yàn)

取1mL的金黃色葡萄球菌的菌液加入到含2%瓊脂粉的肉湯培養(yǎng)基中搖勻，再將這含有細(xì)菌的培養(yǎng)基倒入1個(gè)培養(yǎng)皿中（每個(gè)培養(yǎng)皿含有25mL培養(yǎng)基），待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板上平分區(qū)域打出4個(gè)大小一致的孔，在每個(gè)小孔中分別加入等量的O/W型軟膏基質(zhì)、W/O型軟膏基質(zhì)、O/W型萬(wàn)古霉素軟膏、W/O型萬(wàn)古霉素軟膏。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后測(cè)量其抑菌圈直徑的大小。

2.5.2對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

體外透皮抑菌實(shí)驗(yàn)與體外透皮釋放實(shí)驗(yàn)相識(shí)，以6.5mL金黃色葡萄球菌稀釋液（0.1mL的金黃色葡萄球菌菌液和6.4mL的生理鹽水釋放液）作為釋放液。取出的0.1mL的樣品通過(guò)平板稀釋菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算其中的細(xì)菌量。

2.6軟膏劑動(dòng)物藥效試驗(yàn)

將36只體重約為20g健康小白鼠，雌雄各半，平分為6組，其中每組雌雄各半。用硫化鈉溶液脫去小鼠背部大約4cm2面積的毛，露出裸露皮膚，用生理鹽水清洗干凈。用滅菌后的刀片在小鼠背部裸露皮膚處劃下一個(gè)“井”字形的傷口，每天在“井”傷口中央皮下注射5 L的金黃色葡萄球菌菌液，連續(xù)注射3d。5d后每只小鼠背部傷口處都有化膿感染現(xiàn)象，且在“井”中央還有凸起。然后從第6d開(kāi)始，按組分別在小鼠背部“井”傷口中央涂抹適量的O/W型軟膏基質(zhì)、W/O型軟膏基質(zhì)、O/W型萬(wàn)古霉素軟膏、W/O型萬(wàn)古霉素軟膏、市售紅霉素軟膏以及無(wú)菌生理鹽水，并且每天觀察傷口愈合情況。

3結(jié)果

3.1軟膏劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

所制得的W/O型和O/W型萬(wàn)古霉素軟膏劑為白色膏狀物，通過(guò)耐熱耐寒、高速離心試驗(yàn)后，均無(wú)變色、分層、粗化、液化等現(xiàn)象，說(shuō)明所制備的軟膏劑穩(wěn)定性良好。

3.2軟膏劑體外透皮釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

萬(wàn)古霉素的水溶液在6.33～202.40 g·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性良好（如圖2），線性回歸方程：y=10378x-47127 ，r=0.9998。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明該方法的加樣回收率符合要求，在150 g·mL-1、50 g·mL-1、5 g·mL-1濃度下W/O和O/W型萬(wàn)古霉素軟膏評(píng)價(jià)加樣回收率分別為99.12%、99.88%，RSD分別為0.57%、076%。

3.2.2透皮試驗(yàn)結(jié)果

W/O型萬(wàn)古霉素軟膏累積釋放率為44.15%，O/W型萬(wàn)古霉素軟膏劑累積釋放率為53.35%，在6h后2種軟膏劑藥物釋放均趨緩（見(jiàn)表2和圖3）。

3.3軟膏劑透皮抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1軟膏劑體外藥皿抑菌試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：W/O型和O/W型萬(wàn)古霉素軟膏劑均能不同程度的抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，而不含萬(wàn)古霉素的軟膏劑基質(zhì)則無(wú)抑菌作用。

體外透皮抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示在給藥后2h內(nèi)，金黃色葡萄球菌已被殺滅大半數(shù)，8h的時(shí)候O/W型軟膏組的細(xì)菌已全部殺滅，而W/O型軟膏組的細(xì)菌則只有極少量的存活，表明透皮抑菌效果明顯。

3.3.2動(dòng)物藥效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)給藥后小鼠背部“井”字中央凸起膿包的大小和化膿傷口結(jié)疤情況來(lái)判斷各實(shí)驗(yàn)小組治療皮膚感染的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明生理鹽水組（陰性對(duì)照組）與紅霉素軟膏組（陽(yáng)性對(duì)照組）和萬(wàn)古霉素的軟膏組的P值都小于0.05，具有顯著差異。而軟膏劑的基質(zhì)組與生理鹽水組比較P值均大于0.05，無(wú)顯著差異。在給藥后的第3天，萬(wàn)古霉素軟膏劑組的感染治愈率達(dá)100%，比陽(yáng)性對(duì)照組的紅霉素軟膏組的治愈率明顯高（見(jiàn)圖5）。

4討論

通過(guò)對(duì)兩種不同類型的萬(wàn)古霉素軟膏進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)O/W型萬(wàn)古霉素軟膏的釋放速度更快、抑菌效果也更好，其可能原因在于O/W型軟膏中萬(wàn)古霉素處于乳劑外部，且萬(wàn)古霉素在水中的溶解度極好，因此此種軟膏劑更容易分散在水中，從而發(fā)揮藥效。

感染導(dǎo)致的，所以此實(shí)驗(yàn)選擇了革蘭氏陽(yáng)性菌的典型代表金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象萬(wàn)古霉素的抑菌范圍主要是針對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性菌，在皮膚感染中多由革蘭氏陽(yáng)性菌的金黃色葡萄球菌。

基金項(xiàng)目：四川省教育廳項(xiàng)目（14ZB0383）。