組蛋白去乙酰化酶抑制藥對損傷和感染性炎性反應中巨噬細胞表型的影響

崇 巍，曾仁慶

專家論壇

組蛋白去乙酰化酶抑制藥對損傷和感染性炎性反應中巨噬細胞表型的影響

崇 巍，曾仁慶

組蛋白去乙酰化酶抑制藥；表型；損傷；感染

急性百草枯(Paraquat，PQ)中毒及膿毒癥均為常見的急危重癥。PQ是1,1’-二甲基-4,4’-聯吡啶陽離子鹽，一種廣泛應用的快速滅生性除草劑。急性PQ中毒作為一種急性損傷，主要機制是氧化損傷。組織的氧自由基損傷刺激炎性細胞(如巨噬細胞)分泌各種炎性介質，導致過度炎性反應，從而進一步加重損傷，導致多臟器功能不全，病死率高達50%～70%[1-3]。膿毒癥(Sepsis)是感染導致的全身炎性反應[4]。隨著人口老齡化、腫瘤發病率及侵入性醫療措施的增加，膿毒癥的發病率和死亡率不斷的上升，全球每年新增數百萬膿毒癥患者，其中超過1/4的患者死亡。雖然臨床上有許多先進技術等治療措施，但均不能逆轉全身炎性反應及其所帶來的嚴重后果[5,6]。

近年來，巨噬細胞在炎性反應中起主導作用，一直是研究的熱點。當病原體侵入機體時，巨噬細胞立即識別并且將其吞噬，并提呈片段化的多肽給T輔助性細胞，同時釋放促炎因子與趨化因子摧毀病原體，分泌抗炎因子與趨化因子保護機體。在此過程中，巨噬細胞適應局部微環境進行特異性分化(也稱極化)，即M1(促炎)/M2(抗炎)型之間的轉換[7]。

在損傷及膿毒癥中，M1型巨噬細胞高度表達，大量釋放促炎因子，而M2型巨噬細胞表達減少，抗炎因子釋放相對減少。因此，促使M1型向M2型巨噬細胞極化可以削弱過度炎性反應。最近研究表明，通過組蛋白乙酰化修飾調節巨噬細胞的極化對炎性疾病的治療具有潛在價值[8]。筆者對損傷和感染疾病中表觀遺傳修飾對不同功能表型巨噬細胞的影響進行綜述。

1 炎性反應與巨噬細胞表型的關系

巨噬細胞廣泛分布于全身各個組織和器官，在炎性反應及內環境穩態中發揮極其重要的作用[9]。巨噬細胞具有高度異質性，通過受體識別入侵病原體并刺激其特定的活化程序，直接或者間接影響基因和蛋白的表達模式來調節細胞的功能特性[10,11]。巨噬細胞的激活具有復雜多樣性，主要取決于細胞的狀態、組織、炎性因子及病原或損傷相關分子模式[9,12,13]。根據巨噬細胞對不同刺激的反應可分化為M1(促炎)型和M2(抗炎)型，此分化過程稱為巨噬細胞的極化。例如，靜止狀態的巨噬細胞(M0型)，當其膜/核的特異受體(TLR，RIR和NLR)識別入侵的病原體如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)時，激活M0型細胞促使其向M1型極化，釋放大量促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-12及TNF-α)，趨化因子(單核細胞趨化蛋白-1(MPC-1)、IL-1)，活性氧(ROS)及誘生型一氧化氮(iNOS)等，同時高度表達組織性復合體(MHC)-Ⅱ類分子和共刺激分子(CD16/32及CD86)，進而觸發炎性級聯反應[14-17]；當淋巴因子(IL-4、IL-10及1L-13)、轉化生長因子-β(TGF-β)或者糖皮質激素誘導M0型向M2型極化時，分泌IL-10及IL-1RA并且抑制IL-1β、IL-12及TNF-α的產生，從而抑制炎性反應，產生與iNOS合成產物NO具有拮抗作用的精氨酸酶-1(Arg-1)，抑制免疫殺傷作用，發揮保護效應，同時表達甘露醇受體(MRC1/CD206)、清道夫受體(SR)、類幾丁質酶(YM)、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3結合非整合素(DCSIGN/CD209)、半乳糖型C型凝集素-1(MGL-1)及炎性相關的缺氧誘導有絲分裂因子(FIZZ1)等。此外，M2型巨噬細胞在抑制炎性反應、組織損傷與修復、腫瘤抑制等方面也具有重要作用[18]。

不同表型的巨噬細胞可共存于同一組織，維持內環境的穩態。文獻[13]報道巨噬細胞分化和相應基因的轉錄調控的研究，如M1型的極化涉及許多轉錄因子的激活，如NF-κB、AP-1、C/EBPb、PU.1 和IRF，STAT6和PPAR-γ參與M2型的極化。因此，轉錄調控決定炎癥基因表達方式及功能。

2 組蛋白去乙酰化酶抑制藥對炎性反應的影響

表觀遺傳學(epigenetics)是指在基因的DNA序列不發生改變的情況下，基因的表達水平與功能發生改變，并產生可遺傳表型的遺傳現象，而表觀遺傳機制是直接通過DNA的修飾或者間接通過影響存儲DNA的染色體結構調控基因的表達及蛋白質的功能實現[19，20]。下面主要闡述轉錄后修飾的組蛋白乙酰化的影響。

2.1 組蛋白乙酰化與組蛋白去乙酰化酶抑制藥 組蛋白尾N端的乙酰化和去乙酰化是表觀遺傳機制的重要表現形式，影響染色體的結構，最終調控基因的表達。組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)調控組蛋白的乙酰化穩態[21]。HAT促使組蛋白乙酰化，降低DNA與組蛋白的親和力，繼而釋放組蛋白尾連接區的DNA，打開壓縮的染色體，從而利于轉錄機器接近目標DNA。反之，HDAC阻礙組蛋白乙酰化使染色質壓縮，阻隔轉錄因子和目標DNA結合，從而抑制相應基因的轉錄。HAT調節的組蛋白乙酰化和HDAC調節的組蛋白去乙酰化是可逆的動態過程。

真核生物HDAC有18種，分4類：Ⅰ類包括HDACl、HDAC2、HDAC3和HDAC8，Ⅱ類可分為Ⅱa (包括HDAC4、HDAC5、HDAC7及HDAC9)和Ⅱb(包括HDAC6及HDAC10)，Ⅲ類為SIRT(1-7)；Ⅳ類是HDAC11。Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類HDAC是經典的組蛋白去乙酰化酶，依賴Zn2+-金屬酶，是目前組蛋白去乙酰化酶抑制藥(HDAC inhipitor，HDACi)的主要靶向底物。研究較多的依賴Zn2+-金屬酶的HDACi包括：短鏈脂肪酸類(如VPA抑制Ⅰ及Ⅱa類HDAC)、羥肟酸類【如曲古抑菌素(Trichostatin A，TSA)及辛二酰苯胺異羥肟酸( suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)，抑制Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類HDAC】、環四肽類(如Apicidin及FK228，抑制Ⅰ類HDAC)以及其他類(如MC1568及MC1575，抑制Ⅱa類HDAC等)[22-24]。根據抑制HDAC的特異性可分為非選擇性HDACi(如VPA、TSA及SAHA等)與選擇性HDACi(如Apicidin及MC1568等)。Ⅲ類是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴酶，不能被Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類HDAC的抑制藥抑制。Ⅰ類HDAC廣泛分布于各種細胞，主要存在于細胞核內；Ⅱa類HDAC具有組織表達特異性，可在細胞質與細胞核之間轉換[25,26]，甚至在線粒體中表達(如HDAC7)[27]。此外，Ⅰ和Ⅱa類HDAC具有不同的催化活性，Ⅰ類HDAC具有很強的去乙酰化酶的活性，而Ⅱa類HDAC酶促反應不活躍，主要是負責大的多分子復合物(包括Ⅰ類HDAC尤其是HDAC3)和其他的調控因子中的蛋白質的招募[28]。

HDACi具有不同的化學結構，能抑制各種HDAC亞型[29]。盡管Ⅱa類HDAC缺乏明顯的催化活性，但是HDACi可以通過結合殘余的催化位點，影響其構象或者在多分子復合物中影響其他分子間的相互作用，從而抑制Ⅱa類HDAC的功能[30]。HDAC與其他蛋白一樣，受乙酰化、磷酸化、泛素化及類泛素化等翻譯后修飾的影響，HDACi能調控HDAC本身的乙酰化導致其穩定性及活性的變化[31]。

2.2 HDACi對急性PQ中毒所致炎性反應的影響 PQ是1,1’-二甲基-4,4’-聯吡啶陽離子鹽，一種廣泛應用的快速滅生性除草劑。急性PQ中毒作為一種急性損傷，主要機制是氧化損傷。組織的氧自由基損傷刺激炎性細胞(如巨噬細胞)分泌各種炎性介質，導致過度炎性反應，從而進一步加重損傷，導致多臟器功能不全，病死率高達50%～70%[1-3]。目前尚無特效解毒藥物，各種治療方法療效均不理想[32]。筆者前期研究發現HDACi SAHA可抑制PQ刺激巨噬細胞產生M1型標志物(ROS與TNF-α)[33]。目前，HDACi在急性PQ中毒方面的應用未見其他報道，這提示HDACi對急性PQ中毒可能具有潛在的治療價值。

2.3 HDACi對膿毒癥所致炎性反應的影響 膿毒癥是由感染引起的全身炎性反應綜合征[5]。隨著人口老齡化、腫瘤發病率及侵入性醫療措施的增加，膿毒癥的發病率和死亡率逐年上升。全球每年新增數百萬膿毒癥患者，其中超過1/4的患者死亡[6]。目前對其沒有特效治療藥物，預后極差，雖臨床上存在許多先進技術等治療措施，但也不能逆轉全身炎性反應及其所帶來的嚴重后果。HDAC是細胞乙酰化狀態的重要調節者，參與免疫細胞(如巨噬細胞)的激活，促炎或者抗炎信號的傳導[34]。在分子水平，膿毒癥能使蛋白乙酰化水平失衡，導致過度炎性反應，而HDACi能逆轉此種變化[35]。研究發現非選擇性HDACi (SAHA、TSA及VPA)能減輕LPS刺激鼠的炎性反應[8,35,36]，也能明顯抑制LPS刺激巨噬細胞IL-1β、IL-6、和TNF-α等基因和蛋白水平的表達[35,37]，但是非選擇性HDACi是通過何種HDAC亞類發揮抗炎效應目前尚不清楚。在膿毒癥動物模型中，選擇性HDACi TubA能改變血液循環中細胞的成分，提高該動物的生存率[38]，選擇性HDACi EX-527[39]和AGK2[40]也能提高該動物的生存率。而選擇性HDACi Apicidin和 MC1568在膿毒癥方面的應用未見報道。因此，分析非選擇性HDACi通過何種HDAC亞類發揮抗炎效應，可能有助于選擇更特異及療效更佳的HDACi用于膿毒癥治療。

3 HDACi對膿毒癥巨噬細胞表型的影響

基于非選擇性HDACi的抗炎活性及巨噬細胞在炎性反應中調控促炎或者抗炎的作用，非選擇性HDACi抑制LPS誘導的炎性反應可能與巨噬細胞促炎(M1)表型極化相關。研究表明非選擇性HDACi(VPA及SAHA)能抑制M1型標志物的表達[17,34]，TSA可削弱膿毒癥誘導的急性肺損傷的炎性反應及抑制巨噬細胞M1表型極化。McWhorter等[41]研究表明巨噬細胞形態是M1/M2表型的關鍵標記，而Mariana等[42]研究提示抑制HDAC活性導致巨噬細胞形態的轉變[42]。最新研究表明HDAC Ⅱa抑制藥促進受損神經細胞存活與生長，而HDAC I類抑制藥無此效應[24]，這提示Ⅰ和Ⅱa類HDAC在膿毒癥炎性反應中可能具有不同作用，有待進一步研究。

選擇性HDACi能抑制PQ及LPS誘導的炎性反應，且選擇性HDACi抑制LPS誘導的炎性反應與巨噬細胞M1表型極化相關，但是選擇性HDACi通過何種HDAC的亞類發揮的抗炎作用目前尚不十分清楚。Alam研究團隊發現TubA(Ⅱb HDACi)，AGK2(Ⅲ類HDACi)和EX-527(Ⅲ類HDACi)能提高膿毒癥動物模型的生存率，但特異性抑制Ⅰ或者Ⅱa類的HDACi對膿毒癥和急性PQ中毒炎性反應的影響的研究尚未見報道。

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(2017-03-20收稿 2017-05-20修回)

(責任編輯 梁秋野)

R329.28

國家自然基金面上項目(81350120)；遼寧省自然基金面上項目(201602815)；沈陽市科技計劃(F15-139-9-24)

崇 巍，教授，主任醫師，碩士、博士研究生導師。

110001 沈陽，中國醫科大學附屬第一醫院急診科