丙戊酸對實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠的神經(jīng)元細胞保護作用研究*

程習輝，張 鵬，閔有會，周文科

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450000；2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 450000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南新鄉(xiāng) 453100)

·經(jīng)驗交流·

丙戊酸對實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠的神經(jīng)元細胞保護作用研究*

程習輝1，張 鵬2，閔有會1，周文科3△

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450000；2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 450000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南新鄉(xiāng) 453100)

目的 探討丙戊酸(VPA)對實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)小鼠的神經(jīng)元細胞保護作用，通過不同時間點的變化規(guī)律，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。方法 將小鼠分為正常組，實驗模型組(SAH組)，生理鹽水組(對照組)和SAH+VPA組，分別檢測4個觀察點(6、12 、24 、72 h)熱休克蛋白70(HSP70)的表達,將小鼠在各時間點斷頭取腦，通過免疫組織化學法觀察HSP70陽性表達、雙扼共聚焦觀察神經(jīng)元細胞的變化規(guī)律及TUNEL分析細胞凋亡個數(shù)。結(jié)果 HSP70在SAH+VPA組中各時間點的表達與正常組、SAH組及對照組比較均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；神經(jīng)元細胞在SAH+VPA組的細胞數(shù)與SAH組或?qū)φ战M比較明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TUNEL陽性細胞數(shù)在SAH+VPA組各時間點與SAH組或?qū)φ战M同一時間點比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 VPA能夠改善SAH后小鼠的神經(jīng)功能；并且有保護神經(jīng)細胞、抗細胞凋亡作用。

丙戊酸；蛛網(wǎng)膜下腔出血；神經(jīng)元；細胞凋亡

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一種常見的神經(jīng)外科急癥,其導致出血的常見原因是顱內(nèi)動脈瘤破裂[1-2]。由于動脈瘤治療費用高，并且有較高的致殘率及病死率,因此研究此病尤為重要[3-4]。一些研究指出早期腦損傷(early brain injury,EBI)是SAH致死、致殘的主要原因，而EBI的分子機制及信號通路尚不十分明確。丙戊酸(valproic acid,VPA)作為在臨床上治療癲癇病的一種常見藥,大量文獻報道VPA對早期腦損傷、腦缺血、神經(jīng)功能缺陷及脊髓損傷都有明顯改善作用[5-7]。本研究利用VPA治療小鼠SAH，探討其對實驗性SAH小鼠的神經(jīng)元細胞保護作用,并通過分析各組別不同時間點的變化規(guī)律,為臨床治療SAH提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取健康清潔級成年雄性昆明小鼠84只(體質(zhì)量28～31 g),由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供[許可證號SCXK豫2010-0002,質(zhì)量合格證編號0000423],根據(jù)隨機數(shù)字表法把小鼠分為正常組(取6只),實驗模型組(SAH組，取24只),生理鹽水組(對照組，取24只)和SAH+VPA組(A組，取24只)；再將后3組分成6、12、24、72 h 4個亞組(每亞組取6只)；剩余6只用于制作氧合血紅蛋白(oxyhemoglobin,OxyHb)。

1.2 主要試劑 VPA購于美國Sigma公司，兔抗Cleaved caspase-3及兔抗Bcl-2購自Cell Signaling Technology公司，小鼠GFAP和小鼠Neun購自Millipore公司，兔抗HSP70購自Santa Cruz公司，TUNEL凋亡試劑盒購自Roche公司。

1.3 主要儀器 日本尼康A(chǔ)Z-C2雙扼共聚焦，日本Nikon ECLIPSE 55i免疫熒光顯微鏡，上海光電技術(shù)有限公司XSZ-P-Ⅰ型醫(yī)用顯微手術(shù)電鉆,美國Thermo Scientific CL31R低溫離心機，上海Mettler公司電子天平。

1.4 方法

1.4.1 OxyHb制作 取小鼠全血10 mL,肝素(100 U/mL)抗凝,4 ℃低溫離心機離心10 min,取下層液,用0.9%氯化鈉液反復洗3次,旋渦混合器振蕩2 min碎膜,再離心20 min,取黑紅色下層液,重復2次后保留下層溶液,過濾、透析24 h后,分裝OxyHb,置于4 ℃冰箱,用于制作SAH模型。

1.4.2 模型制作 采用師蔚等[8]方法制作SAH模型，并依據(jù)此法制作其他實驗組：對照組在小鼠SAH模型注射等量的無菌生理鹽水；SAH+VPA組于SAH模型制作完成30 min后,按0.3 mg/g的劑量給藥VPA,術(shù)后均將小鼠分籠飼養(yǎng)在動物專用飼養(yǎng)室(室溫26 ℃,相對濕度60%～70%),最后分別在各試驗組所設(shè)定時間點將小鼠斷頭,取其右側(cè)大腦皮層,制作4 μm石蠟切片。

1.4.3 神經(jīng)行為學評分 采用NSS評分[9],從運動、感覺、反射和異常活動等幾個方面進行評估。

1.4.4 HSP70水平檢測 嚴格按照免疫組織化學試劑盒上實驗操作步驟進行。

1.4.5 神經(jīng)元細胞的檢測 其操作過程與免疫組織化學檢測PBS相同,在山羊血清封閉前10 min依次加入小鼠GFAP及小鼠Neun(1∶100),其余步驟相同，常規(guī)封片，雙扼共聚焦顯微鏡進行檢測。

1.4.6 神經(jīng)細胞的凋亡檢測 載玻片提前10 min用APES處理,按TUNEL凋亡試劑盒使用說明對腦組織切片進行染色,熒光顯微鏡觀察。陽性結(jié)果判定:每只小鼠取5張切片,置于400倍熒光顯微鏡下,取3個不重復視野觀察,統(tǒng)計陽性細胞數(shù)(細胞核呈綠色)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)行為學檢測結(jié)果 采用NSS來評價小鼠神經(jīng)功能，

表1 各組不同時間點NSS評分結(jié)果

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與其他各組比較。

其數(shù)值越高反應損傷越重。造模后于6、12、24、72 h對各個組別的小鼠進行評分， 各實驗組之均采用雙盲法評分。如表1所示：VPA治療后小鼠神經(jīng)功能有不同程度的恢復，在SAH后24 h內(nèi)SAH+VPA組與SAH組或?qū)φ战M間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；VPA治療后72 h SAH+VPA組運動功能改善與平衡能力的提高程度明顯優(yōu)于SAH組或?qū)φ战M，SAH+VPA組與SAH組或?qū)φ战M間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

a:P<0.05,b：P<0.01，與正常組比較；c：P<0.01,與SAH組、對照組比較。

圖1 HSP70免疫組織化學分析圖

圖2 VPA對SAH后24 h時腦皮層神經(jīng)元細胞及 神經(jīng)膠質(zhì)細胞的表達(×400)

2.2 免疫組織化學染色檢測結(jié)果 本實驗研究正常組由于小鼠受到外界的干涉很少，HSP70在各時間點陽性表達變化不大，基本保持一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，而在SAH組中HSP70陽性表達在6、12、24 h的均顯著增多，與正常組中同一時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。然而，在對照組中各時間點亞組與SAH組基本保持一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與正常組相比(除72 h時間點，P=0.0733)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在SAH+VPA組中各時間點亞組的表達較正常組、SAH組及對照組均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05,與正常組比較；b：P<0.01,與SAH組或?qū)φ战M比較。

圖3 腦皮層神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的表達分析

圖4 小鼠各實驗組不同時間點大腦皮層 細胞凋亡情況(TUNEL×200)

a：P<0.05,與正常組比較；b：P<0.01,與SAH組或?qū)φ战M比較。

圖5 細胞凋亡分析

2.3 神經(jīng)元細胞檢測結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)正常組中可觀察到大量的神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，但在SAH組及對照組中出現(xiàn)了神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量上的明顯減少，而在SAH+VPA組兩種細胞陽性個數(shù)較SAH組或?qū)φ战M中明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2、3。

2.4 細胞凋亡變化結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)正常組中僅發(fā)現(xiàn)極少量凋亡細胞，隨后6、12、24、72 h時的凋亡細胞數(shù)逐漸增多，其中以72 h陽性細胞數(shù)最多，在對照組中各時間點與SAH組相比變化不大，而在SAH+VPA組各時間點的凋亡細胞數(shù)與SAH組或?qū)φ战M相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4、5。

3 討 論

VPA作為臨床上治療癲癇常用藥物是安全、可靠的，而VPA又作為組蛋白去乙酸化酶抑制劑，有抗細胞凋亡、減少細胞炎性反應發(fā)生、促進細胞再生的作用。目前，關(guān)于VPA在神經(jīng)保護方面的研究不多，本研究發(fā)現(xiàn)VPA可使SAH后小鼠運動功能改善與平衡能力明顯提高， HSP70高表達，神經(jīng)元細胞數(shù)量上的明顯增多，受損的神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量比SAH組或?qū)φ战M中同一時間點明顯減少。

在SAH早期，細胞凋亡常出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，其細胞凋亡機制常涉及多個經(jīng)典的凋亡通路，目前對其研究最多的是蛋白激酶B(Akt蛋白)和絲裂原活化蛋白激酶導致的凋亡過程，Akt蛋白通過促進反應元件結(jié)合蛋白磷酸化，激活Bcl-2家族，而Bcl-2家族可導致線粒體膜通透性的增加，促使細胞色素C大量釋放，最終出現(xiàn)caspase級聯(lián)反應，誘發(fā)整個細胞凋亡過程[10-14]。SAH可引起EBI及腦血管痙攣，繼而出現(xiàn)腦水腫，并通過OxyHb引起氧化應激、上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶、產(chǎn)生炎性因子等導致SAH后神經(jīng)細胞受損，最終使神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡等一系列病理生理變化[15]。本實驗通過對凋亡的神經(jīng)細胞核顯色，發(fā)現(xiàn)在SAH組及對照組在6～72 h之間，其細胞凋亡數(shù)量逐漸增多，而SAH+VPA組與前兩者比較均出現(xiàn)凋亡細胞的減少(P<0.01)，這表明VPA在一定程度上可抑制細胞凋亡，其這一結(jié)論與國內(nèi)外的報道基本相似[16]。本實驗通過雙標染色發(fā)現(xiàn)：SAH+VPA組中的神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量較SAH組或?qū)φ战M中明顯增多，VPA能夠抑制星形膠質(zhì)細胞的分化，通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄基因NeuroD表達，促使干細胞分化成神經(jīng)元，進而減少瘢痕組織的生成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起到修復、保護神經(jīng)細胞的作用[17]，這表示VPA對神經(jīng)損傷有保護作用。

在正常情況下，HSP70在腦組織內(nèi)含量很少，當機體受到應急、應激反應時，大腦組織中的大多數(shù)蛋白合成出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，但HSP70出現(xiàn)了高表達，通過對抗各種反應，從而起到腦細胞的保護作用。吳馳等[18]也發(fā)現(xiàn)VPA通過HSP70的高表達來減少神經(jīng)細胞凋亡的作用，HSP70的陽性表達率與細胞凋亡指數(shù)成正比。本實驗研究發(fā)現(xiàn)HSP70在SAH+VPA組中各時間點的表達較正常組、SAH組及對照組均顯著增高，其中在24 h到達高峰，這說明 VPA上調(diào)了HSP70的表達，進而減少神經(jīng)細胞凋亡。其受損細胞的最佳恢復時間窗可能是24 h，對此結(jié)論還需大量的試驗數(shù)據(jù)給予證實。同時一些資料表明：VPA通過誘導大鼠腦組織中的HSP70高表達，同時抑制細胞色素C依賴的caspase-3途徑、下調(diào)磷酸醋酶A2和凋亡誘導因子活性，降低蛋白大量聚集，最終起到抗神經(jīng)細胞凋亡作用[19]。

總之，VPA在一定程度上可抑制細胞凋亡，促使HSP70的高表達，減少神經(jīng)元細胞損傷程度，進而發(fā)揮腦保護的作用。VPA鈉作為臨床上已使用的藥物，及其潛在的神經(jīng)保護作用，筆者推測VPA在SAH后24 h這一時間段可能是治療SAH最佳時間。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.033

國家自然基金資助項目(81541030)。

程習輝(1985-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管病基礎(chǔ)與臨床研究。△

，E-mail:zhouwenke1999@163.com。

R743.35

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1671-8348(2017)06-0824-04

2016-10-22

2016-11-24)