先兆流產與MTHFR、MTRR基因多態性的關系*

李小蘭，林瓊珊，魯衍強，李 瑛，湯 萍△，陳春寶，楊 琦

(1.重慶市黔江區中心醫院婦產科，重慶 409099;2.海南省三亞市婦幼保健院婦產科 572000;3.上海靶向分子醫學研究所，上海 200433;4.海南主健細胞分子遺傳醫學檢驗中心，海口 570206;5.中國疾病預防控制中心婦幼保健中心，北京 100101)

論著·臨床研究

先兆流產與MTHFR、MTRR基因多態性的關系*

李小蘭1，林瓊珊2，魯衍強3，李 瑛3，湯 萍3△，陳春寶4，楊 琦5

(1.重慶市黔江區中心醫院婦產科，重慶 409099;2.海南省三亞市婦幼保健院婦產科 572000;3.上海靶向分子醫學研究所，上海 200433;4.海南主健細胞分子遺傳醫學檢驗中心，海口 570206;5.中國疾病預防控制中心婦幼保健中心，北京 100101)

目的 調查葉酸代謝相關基因5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)多態性與先兆流產的關系。方法 選擇海南省三亞市婦幼保健院在2009-2011的139例具有先兆流產癥狀的育齡婦女(病例組)和139例健康對照(對照組)來進行病例對照研究，通過刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，提取其基因組DNA，對受檢者MTHFR和MTRR基因多態性采用熒光定量PCR進行分析檢測。通過分析病例組和對照組基因多態性的分布差異，評估其與先兆流產的相關性。結果 病例組和對照組基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，但經比較分析，病例組MTHFR C677T、MTHFR A1298C和 MTRR A66G的基因型構成與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。結論 在先兆流產患者和健康人中，基因多態性分布無顯著差異，葉酸代謝相關基因是否為先兆流產的風險因子還有待進一步研究。

葉酸代謝障礙；流產, 先兆；基因;多態性, 單核苷酸；5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶；甲硫氨酸合成酶還原酶

先兆流產(threatened abortion/threatened miscarriage)是一種常見的孕期并發癥[1-2]。發生率約占20%。其流產率是正常群體的2.6倍，17%的患者在懷孕后期會產生并發癥[3]。先兆流產的結局對于妊娠婦女及其家庭都是一件非常焦慮的事情，因此對于先兆流產進行積極地干預顯得非常必要。

葉酸(folic acid)是人體所需的重要營養素，屬于B族維生素。葉酸在體內被還原成具有生理活性的四氫葉酸，作為一碳單位的供體，主要參與DNA氧化損傷修復、細胞增殖及組織生長過程[4-5]。在葉酸代謝通路中，有多種酶共同參與了葉酸的轉運和代謝，其中5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methionine synthase reductase，MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTRR)兩個酶最為關鍵，這些酶基因在自然人群中存在一些單核茵酸多態性(SNP)，其突變可引起酶活性的改變[6]，并造成葉酸代謝的異常，使得活性葉酸水平降低[7]及同型半胱氨酸(Hcy)水平升高[8-9]。血漿Hcy水平升高與神經管畸形(NTDs)、先天性心臟病(CHD)和唐氏綜合征(DS)等多種出生缺陷的發生，以及妊娠高血壓(PIH)、復發性流產(RLP)等孕期疾病密切相關。

目前，關于先兆流產和葉酸代謝的關系鮮有文獻報道，而關于先兆流產與其易感基因型的文獻也少有發現。本研究通過對海南省三亞市罹患先兆流產的漢族女性的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態性進行分析，通過病例對照研究，分析其基因多態性和先兆流產的關系，對先兆流產干預指導的可行性進行了探索性的理論積累。

表1 Taqman-MGB探針所在位置

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2009年1月至2011年12月在海南省三亞市婦幼保健院被確認為先兆流產的漢族女性，對照組為該院選取的與其年齡，民族，檢測時期相匹配的無先兆流產的普通女性。入組受檢者之間無血緣關系。入組標準為：(1)均為排除嚴重的器質性病變及子宮附件疾病的健康女性；(2)均獲得研究對象知情同意。病例組平均年齡(26.69±4.37)歲，對照組平均年齡(26.73±4.69)歲，各收集樣本139例。

1.2 方法

1.2.1 標本DNA采集 本研究采集的檢測標本為受檢者的口腔黏膜上皮脫落細胞。受檢者簽署知情同意書后，由專業人員進行口腔黏膜細胞采樣，樣本送至生物公司進行分析。檢驗采用采樣拭，在口腔內上下輕刮幾十下，采用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA，試劑盒購自上海生工生物公司。

1.2.2 基因型檢測 采用Taqman-MGB技術，使用Taqman-MGB探針的real time PCR反應，檢測MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的基因多態性。檢測過程中所使用的儀器和試劑均購買自美國ABI公司。該反應所使用的儀器為ABI7900HT熒光定量PCR儀，將DNA模板(20 ng/μL，1 μL)、探針(20×Taqman-MGB，具體信息見表1)及引物(2×Taqman Universal Master Mix 5 μL)投入儀器，每個反應體系總體積10 μL。設定反應溫度95 ℃反應10 min后，92 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，20個循環；之后89 ℃反應15 s，60 ℃退火1.5 min，循環30次。最后，在PCR儀上讀取反應重點，并利用分析軟件確定基因分型結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗采用t檢驗。病例組和對照組葉酸代謝障礙關鍵酶MTHFR(C677T、A1298C兩個位點)和MTRR(A66G位點)基因多態性及頻率分布的差異比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡性 病例組和對照組MTHFR、MTRR基因多態性分布特征均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明數據標本的選擇來源于同一個孟德爾群體。

表2 兩組女性MTHFR、MTRR基因型頻數 和等位基因頻率分布比較[n(%)]

2.2 病例組和對照組MTHFR、MTRR基因型分析 通過分析該兩組人群的MTHFR C677T、MTHFR A1298C和 MTRR A66G基因型的構成情況，發現病例組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 病例組和對照組MTHFR、MTRR等位基因頻率分析 病例組女性的MTHFR 677T等位基因頻率(11.5%)與對照組(8.6%)比較無統計學差異(P>0.05)。病例組MTHFR 1298C等位基因頻率(25.2%)和對照組(21.9%)的差異以及MTRR 66G等位基因在病例組(25.5%)和對照組(28.8%)的差異，均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組女性MTHFR、MTRR等位基因頻率 分布及風險系數[n(%)]

3 討 論

葉酸是一種水溶性維生素，對光和熱敏感，在食物的烹調加工過程中極易遭到破壞；同時葉酸吸收還受腸道pH值、代謝產物、厭氧菌等諸多因素的影響，故盡管食物中含量豐富，實際被人體攝入、吸收利用很有限。孕婦特殊的生理需求，導致其對葉酸的需求量約為常人的2～3倍。雖然按照我國現行的公衛政策，孕婦在孕前3個月至孕早期3個月，每天補充400微克的葉酸，但由于每個個體的遺傳體質存在差異，仍有相當一部分人群由于MRHFR、MTRR基因發生風險突變而導致其對葉酸的利用能力降低，攝入體內的葉酸不能有效地轉化成5-甲基四氫葉酸，因此孕婦極易發生葉酸缺乏。葉酸代謝障礙會使得一系列與其通路密切相關的疾病發生風險增高，比如胎兒神經管畸形及唇腭裂，Down綜合征，以及自發性流產、胎兒宮內發育遲緩、早產及新生兒低出生體質量等[10-11]。但是葉酸代謝障礙是否會增加先兆流產的風險尚不得知。

葉酸代謝途徑中的關鍵基因MTHFR基因的C677T、A1298C位點的基因多態性對其編碼的酶的活性和熱穩定性有巨大影響[9]。例如，攜帶TT基因型的人群，其MTHFR酶活性在37 ℃時，較正常基因型CC型降低50%～60%；MTHFR C677T與A1298C發生協同作用時，也會導致其編碼的酶活性減弱，只有正常基因型的36%[12]。MTRR GG66基因型和AA66基因型比較，個體發生神經管缺陷(NTDs)的風險增加到2.6倍 (OR=2.6，95%CI：1.3～5.3)[11]。這3個基因位點的突變均為錯義突變。除此以外，眾多研究表明，MTHFR C677T基因多態性還會增加前列腺癌[13]、口腔癌[12]、甲狀腺癌[14]等癌癥，以及腦血管疾病[15]、Ⅱ型糖尿病[16]等很多疾病的風險。與此同時，MTHFR A1298C也與包括宮頸癌[17]等多種疾病易感性相關，所以該基因會對多種疾病的發生和發展產生影響。

黃曉玲等[18]在一項針對中山市孕齡女性的研究中發現，先兆流產病例組的MTHFR C677T位點TT基因型占總體比例的15.4%，是對照組TT型所占比例的兩倍以上；病例組的MTHFR A1298C位點CC型占5.5%，對照組則未檢出該基因型。該結果提示以上兩位點的純合突變與先兆流產有一定關聯性。但是，本研究通過比較病例組和對照組C677T等位基因的頻率分布及組合，并未發現兩組數據之間存在統計學差異。可能由于研究對象來自不同地域，其基因多態性分布特點、所處環境及生活習慣不同，導致研究結果不同。先兆流產的治愈不僅僅需要葉酸，更依賴的是雌激素[19]。這暗示葉酸代謝障礙相關基因位點的改變有可能并非導致先兆流產的充分條件，兩者之間的關系也有待進一步研究。

先兆流產是孕期常見的臨床病癥之一，近年來，發病率呈現不減反增的趨勢。由于引起先兆流產的原因復雜多樣，導致臨床難以作出明確的病因診斷。先兆流產不僅對孕婦身心造成較大傷害，對胎兒及新生兒健康也有較大影響[20]。因此，通過開展先兆流產的相關因素的調查，有望找出導致先兆流產的潛在影響因素，并分析各因素之間關聯程度，有助于為其防治工作提供理論依據，為孕婦的孕期保健工作奠定基礎。低葉酸水平，Hcy及葉酸代謝酶基因多態性與復發性流產存在明顯關聯[21]，而葉酸代謝關鍵酶基因多態性與先兆流產之間相關性研究較少。因此，通過MTHFR和MTRR的大樣本分子流行病學調查，了解其與先兆流產的關系，對于先兆流產的積極干預有一定的創新意義。

[1]Ahmed SR,El-Sammani Mel K,Al-Sheeha MA,et al.Pregnancy outcome in women with threatened miscarriage:a year study[J].Mater Sociomed,2012,24 (1):26-28.

[2]Sotiriadis A,Papatheodorou S,Makrydimas G.Threatened miscarriage:evaluation and management[J].BMJ,2004,329(7458):152-155.

[3]Hanita O,Roslina O,Azlin MI.Maternal level of pregnancy-associated plasma protein A as a predictor of pregnancy failure in threatened abortion[J].Malays J Pathol,2012,34 (2):145-151.

[4]Rolschau J,Date J,Kristoffersen K.Folic acid supplement and intrauterine growth[J].Acta Obstet Gynecol Scand,1979,58 (4):343-346.

[5]Stefanovic S,Jancic MS,Banicevic B,et al.Disorders of vitamin B12 and folic acid metabolism[J].Srp Arh Celok Lek,1973,101 (3):261-272.

[6]Haggarty P,Campbell DM,Duthie S,et al.Folic acid use in pregnancy and embryo selection[J].BJOG,2008,115 (7):851-856.

[7]Thawnashom K,Tungtrongchitr R,Petmitr S,et al.Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) polymorphism (C677T) in relation to homocysteine concentration in overweight and obese Thais[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health,2005,36(2):459-466.

[8]Zappacosta B,Graziano M,Persichilli S,et al.5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T and A1298C polymorphisms:genotype frequency and association with homocysteine and folate levels in middle-southern Italian adults[J].Cell Biochem Funct,2014,32(1):1-4.

[9]朱海燕,羅克嫻.葉酸缺乏研究綜述[J].中華臨床醫藥,2003,4(7):59-60.

[10]Zhu H,Wicker NJ,Shaw GM,et al.Homocysteine remethylation enzyme polymorphisms and increased risks for neural tube defects[J].Mol Genet Metab,2003,78(3):216-221.

[11]Fard-Esfahani P,Mohammadi Torbati P,Hashemi Z,et al.Analysis of relation between C677T genotype in MTHFR gene and prostatic cancer in Iranian males[J].Acta Med Iran,2012,50(10):657-663.

[12]Jia J,Ma Z,Wu S.Positive association between MTHFR C677T polymorphism and oral cancer risk:a meta-analysis[J].Tumour Biol,2014,35(5):4943-4948.

[13]Chango A,Boisson F,Barbe F,et a1.The effect of 677C/T and 1298A/C mutations on plasma homocysteine and 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase activity in healthy subjects[J].Br J Nutr,2000,83:593-596.

[14]Yang YM,Zhang TT,Yuan L,et al.The association between the C677T polymorphism in MTHFR gene and the risk of thyroid cancer:a meta-analysis[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(15):2097-2101.

[15]Zhang MJ,Li JC,Yin YW,et al.Association of MTHFR C677T polymorphism and risk of cerebrovascular disease in Chinese population:an updated meta-analysis[J].J Neurol,2014,261(5):925-935.

[16]Tutuncu NB,Erbas T,Alikasifoglu M,et al.Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase enzyme genotype is frequent in type 2 diabetic patients with normal fasting homocysteine levels[J].J Intern Med,2005,257(5):446-53.

[17]Yu L,Chang K,Han J,et al.Association between Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and susceptibility to cervical cancer:a meta-analysis[J].PLoS One,2013,8 (2):e55835.

[18]黃曉玲,何艷君，魯衍強,等.亞甲基四氫葉酸還原酶多態性與先兆流產相關性研究.[J]贛南醫學院學報,2015,1(35):41-47.

[19]Alimohamadi S,Javadian P,Gharedaghi MH,et al.Progesterone and threatened abortion:a randomized clinical trial on endocervical cytokine concentrations[J].J Reprod Immunol,2013,98(1):52-60.

[20]Toner JP,Flood JT.Ferlility after the age of 40 [J].Obstete Grnecol Clin North Am,1993,20(2):261.

[21]Rohini R N,Khanna A,Singh S,et al.MTHFR C677T polymorphism and recurrent early pregnancy loss risk in North Indian population[J].Reprod Sci,2012,19(2):210-215.

Investigation of the correlation of genetic polymorphism of MTHFR and MTRR and the threatened abortion*

LiXiaolan1,LinQiongshan2,LuYanqiang3,LiYing3,TangPing3△,ChenChunbao4,YangQi5

(1.DepartmentofGynaecology,QianjiangCentralHospital,Chongqing409099,China;2.DepartmetofGynarcologyandObstetrics,SanyaMaternalandChildHealthHospital,Sanya,Hainan572000,China;3.InstituteofTargetedTherapyandMolecularMedicineofShanghai,Shanghai200433,China;4.HainanZhujianCenterofMolecularCytogeneticClinicalTesting,Haikou570206，China;5.MaternalandChildren′sHealthCenter,theChineseCenterforDrseaseControlandPrevention,Beijing100101,China)

Objective To investigate the influence of the genotype distribution of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T,A1298C and methionine synthase reductase (MTRR) A66G in threatened abortion of Chinese Han gestational-age women in Sanya city,which involved in the folic acid biosynthetic pathway among.Methods One hundred and thirty-nine samples of case group and the same number of control group were recruited from Sanya region in Hainan Province.Genomic DNA was extracted from the mucosal epithelium of the subjects.The gene polymorphisms of MTHFR and MTRR were detected by Fluorescence quantitative PCR technology.The distribution frequencies of both case group and control group were analyzed and compared,to investigate the effect of the gene polymorphisms on threatened abortion.Results Both the case group and the control group complied with Hardy-Weinberg law.The genotype frequency of MTHFR C677T,MTHFR A1298C and MTRR A66G were not significantly different.Conclusion This study suggests that the gene polymorphism which involved in folic metabolism was not significantly different from the group of threatened abortion and the control group,and whether the metabolism related genes are the risk factors of threatened abortion need to be further discussed.

folic acid biosynthetic pathway;abortion,threatened;gene;polymorphism,single nucleotide;5,10-methylenetetrahydrofolate reductase;methionine synthase reductas

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.016

中國疾病預防控制中心婦幼保健中心婦幼保健分子遺傳醫學研究專項計劃(FY-ZX-ZD-0050)；三亞市醫療衛生科技創新項目(YW1231)。

李小蘭(1981-)，主治醫師，本科，主要從事圍產期保健研究。△

，E-mail:tangping@genechina.com。

R715.5

A

1671-8348(2017)06-0770-03

2016-10-25

2016-11-23)