胃內容物鼻咽部反流與腺樣體組織免疫狀態的相關性研究*

張春林,林小燕,李春雷,饒 澄,王 科,3,劉兆輝△

(1.遵義醫學院附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州遵義 563003;2.廣東省婦幼保健院耳鼻咽喉科，廣州 510310;3.西安醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科 710077)

論著·臨床研究

胃內容物鼻咽部反流與腺樣體組織免疫狀態的相關性研究*

張春林1,林小燕2,李春雷1,饒 澄1,王 科1,3,劉兆輝1△

(1.遵義醫學院附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州遵義 563003;2.廣東省婦幼保健院耳鼻咽喉科，廣州 510310;3.西安醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科 710077)

目的 研究腺樣體肥大(AH)患兒中胃內容物鼻咽部反流與腺樣體免疫狀態的相關性。方法 收集AH病例，分為AH不伴扁桃體肥大組(A組)，AH伴扁桃體肥大組(B組)，收集無腺樣體和扁桃體肥大的患兒作為對照組。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的表達，免疫組織化學法檢測腺樣體組織中BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20的表達，進一步分析胃蛋白酶水平與BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20的相關性。此外，分析上述指標表達水平與AH程度的相關性。結果 A組和B組中胃蛋白酶平均水平分別為(2.91±1.69)ng/mL，(2.70±1.42)ng/mL，胃蛋白酶陽性率分別為57.1%和54.6%，均高于對照組(P<0.01)，而A組和B組的胃蛋白酶平均水平和陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20在腺樣體組織中的表達，B組有高于A組的趨勢，但僅CD20表達差異有統計學意義(P=0.042)。胃蛋白酶與BCL-2、PCNA、CD45Ro，CD20表達呈正相關(均P<0.01)，相關系數分別為0.64，0.66，0.63，0.58。此外，在根據AH程度分組的亞組比較中，胃蛋白酶陽性率差異有統計學意義(P=0.022)，BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20 的表達水平均與腺樣體的分度有關(P<0.01)。結論 鼻咽部分泌物中胃蛋白酶表達水平與腺樣體的免疫反應活躍程度相關，胃內容物鼻咽部反流可能是AH的可能病因。

腺樣體肥大；胃食管反流；鼻咽反流；胃蛋白酶 A；免疫活性

腺樣體位于鼻咽部，是機體的免疫器官，具有體液免疫和細胞免疫的作用。腺樣體肥大(adenoid hypertrophy,AH)是小兒的常見病、多發病，具體病因尚未完全明確，臨近器官病變刺激、病原微生物感染及變態反應等都是可能的病因[1]。近年，耳鼻喉科醫師對胃內容物反流到上呼吸道、消化道而產生的致病作用有了較深入的認識。有研究報道胃內容物反流可以引起慢性咽喉炎、慢性鼻竇炎、分泌性中耳炎等[2-4]，其主要致病因素是胃酸和胃蛋白酶[5]。此外，AH與胃內容物反流的相關性也被重視[6]，本研究前期發現部分AH患兒中存在胃內容物的鼻咽部反流，并且胃蛋白酶表達與AH程度有一定的關系。有研究報道腺樣體組織內PCNA、BCL-2等標記物的表達水平可以反映腺樣體的免疫狀態[7-8]，當腺樣體受到局部刺激時，腺樣體組織內免疫反應活躍，腺樣體表現為過度增生，本研究前期發現AH患兒的腺樣體組織中呈較活躍的免疫反應狀態，并且該狀態與腺樣體的肥大程度相關。本研究進一步分析胃內容物的鼻咽部分流與腺樣體免疫狀態的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集自2013年6月至2014年12月就診于遵義醫學院附屬醫院耳鼻喉科的AH患兒(堵塞后鼻孔大于50%)，并以扁桃體超出腭舌弓與懸雍垂連線的中線位置作為扁桃體肥大的標準，分組如下：AH不伴扁桃體肥大(A組)，共21例，男11例，女10例，年齡2.9～9.2歲，平均5.2歲；AH伴有扁桃體肥大(B組)，共22例，男12例，女10例，年齡2.5～10.0歲，平均5.5歲。排除標準：(1)近3個月內曾使用質子泵抑制劑等抑酸藥物；(2)患有免疫系統疾病或有其他嚴重系統疾?。?3)2周內曾發生過上呼吸道感染；(4)近3個月內長期使用抗菌藥物、激素等藥物。此外，收集耳前瘺管、耳鼻喉科外傷等需行全身麻醉手術的病例作為對照組，并排除：(1)合并腺樣體和扁桃體肥大的病例；(2)有喉咽反流及胃食管反流癥狀的病例，共22例，男14例，女8例，年齡2.8～12.0歲，平均6.2歲。各組患兒在性別、年齡方面差異無統計學意義(P=0.428，P=0.536)。本試驗的設計、實施均通過遵義醫學院附屬醫院倫理委員會通過，所有試驗標本的獲得及使用均經患者家屬書面同意。

1.2 腺樣體切除術 腺樣體切除術均在氣管插管全身麻醉下進行，術中在鼻內鏡直視下切除腺樣體，合并扁桃體肥大的患兒，同期行扁桃體等離子切除術。術中留取約1 cm2大小的組織用10%甲醛固定，石蠟包埋備用。術后隨訪患者，于術后6個月時復查鼻咽鏡，判定手術療效，以腺樣體超過術前體積的1/2 作為腺樣體再增生的標準。

1.3 胃蛋白酶的檢測 本研究用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行鼻咽部分泌物中的胃蛋白酶的檢測。術中在鼻內鏡直視下用5 mL注射器連接鼻腔吸管收集鼻咽部分泌物2 mL，置于-80°凍存備用。若分泌物黏稠，則以0.1%二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DDT)4倍體積充分混勻，37 ℃水浴10 min。所有標本均于4 ℃下5 000 r/min離心15 min，取上清液，加入到人胃蛋白酶試劑盒(購于永輝生物技術有限公司)，用全自動酶標儀(Thermo公司)檢測。

1.4 免疫組織化學檢測 石蠟切片經60 ℃烘片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇沖洗。將切片置于pH 6.0的0.1 mol/L的枸櫞酸液修復液中，用微波爐加熱至微沸騰，停止加熱后自然冷卻20～30 min。用PBS漂洗，H2O2孵育10 min。PBS 沖洗后滴加封閉液(5% BSA)，室溫下濕盒中孵育30 min。滴加在適宜水平的一抗置濕盒中4 ℃孵育過夜，PBS洗去一抗，滴加生物素化二抗工作液(抗體均購于美國Abcam公司)，室溫下濕盒中孵育20 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫下置濕盒中孵育20 min，用PBS沖洗。DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗。再進行蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.5 結果判定 進行鼻咽部分泌物中胃蛋白酶水平的定量測定，首先繪制標準曲線并進行分析，結果顯示標準品水平與標準曲線測得水平呈現較好的一致性。由于正常兒童也可能存在生理性的胃內容物反流，所以在判定病理性胃蛋白酶鼻咽部反流時用對照組的胃蛋白酶平均水平進行校正，獲得標本的最終胃蛋白酶水平。根據工作曲線及參考文獻[9]，陽性病例的分界值設為2.50 ng/mL，即胃蛋白酶水平大于2.50 ng/mL說明在標本中胃蛋白酶為陽性。進行腺樣體組織中標記物結果的判定時，先在低倍鏡下(×100)選取切片中細胞分布均勻的視野，再在高倍鏡(×400)下觀察以特定著色部位出現棕黃色顆粒為陽性著色，計算陽性細胞數，每個病例隨機觀察4個高倍視野，計算其平均陽性細胞數。

1.6 統計學處理 采用SPSS11.0軟件進行分析。計量資料符合正態分布和方差齊性的采用t檢驗，不滿足者采用Wilcoxon檢驗，計數資料以百分數表示，比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，雙側檢驗，以P<0.05差異為有統計學意義。

2 結 果

2.1 鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的表達 A組、B組和對照組中胃蛋白酶平均水平分別為(2.91±1.69)、(2.70±1.42)、(1.07±0.39)ng/mL，A組、B組與對照組進行比較差異均有統計學意義(P<0.01)，A組與B組比較差異無統計學意義(P=0.568)，見圖1A；A組和B組中鼻咽分泌物中的胃蛋白酶陽性率分別為57.1%(12/21例)和54.6%(12/22例)，差異無統計學意義(P=0.864)。此外，A組與B組總體平均值及陽性病例平均值比較，差異均無統計學意義(P=0.568，P=0.321)。

2.2 兩組患兒中腺樣體組織中標記物的表達 BCL-2陽性物質位于細胞質和細胞膜，PCNA染色陽性物質位于細胞核， CD45Ro和CD20染色陽性物質位于細胞膜。BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20在腺樣體組織中的表達，總體趨勢上B組高于A組，但僅CD20表達差異有統計學意義(P=0.042)、BCL-2、CD45Ro、PCNA差異均無統計學意義(P值分別為0.123、0.273、0.060)。見圖1B、表1。

A：鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的表達;B:腺樣體組織中各標記物的表達；a:P<0.05。

圖1 各組患者中鼻咽部分泌物中胃蛋白酶和 腺樣體組織中標記物的表達表1 鼻咽部分泌物中胃蛋白酶和腺樣體組織中各標記物的表達±s)

2.3 胃蛋白酶和腺樣體組織中標記物表達的相關性分析 胃蛋白酶與BCL-2、PCNA、CD45Ro，CD20表達呈正相關，差異有統計學意義(均P<0.01)，其r值分別為0.64、0.66、0.63、0.58，表明胃蛋白酶水平與腺樣體組織內的免疫活躍狀態有相關性，見圖2。

2.4 胃蛋白酶和腺樣體組織中標記物表達與AH之間的關系 根據AH程度，將所有病例分成3個亞組，腺樣體Ⅰ度大(堵塞后鼻孔50%～75%)10例，腺樣體Ⅱ度大(堵塞后鼻孔76%～90%)26例，腺樣體Ⅲ度大(堵塞后鼻孔大于90%)7例。24例胃蛋白酶檢測陽性病例中，腺樣體Ⅰ度大組共5例，腺樣體Ⅱ度大組共14例，腺樣體Ⅲ度大組共5例，不同組別中胃蛋白酶陽性率差異有統計學意義(P=0.022)。進一步進行亞組胃蛋白酶表達水平的比較，雖然Ⅱ度以上的總體胃蛋白酶水平及胃蛋白酶陽性病例均較腺樣體Ⅰ組高，但是差異無統計學差異(P=0.191，P=0.321)。此外BCL-2，PCNA，CD45Ro，CD20標記物表達水平與腺樣體的分度有關，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖2 胃蛋白酶水平與腺樣體組織中各標記物表達的相關性

3 討 論

AH嚴重影響兒童的生長發育和生活質量，并可引起慢性鼻竇炎、分泌性中耳炎等并發癥[10]。AH的具體病因尚不明確。新近研究發現，胃內容物反流可能與多種耳鼻喉科疾病相關。Samuels等[11]對文獻綜合回顧分析，認為檢測胃蛋白酶是胃內容物反流診斷的高靈敏度、無創、快速、方便的客觀診斷方法。Knight等[12]發現胃蛋白酶的診斷敏感性為100%，特異性為89%，可以應用于監測咽喉部反流事件。本研究在鼻咽分泌物中檢測到胃蛋白酶，并且發現AH伴或不伴扁桃體肥大患兒的鼻咽部胃蛋白酶陽性率為54.55%和57.14%，與Keles等[13]通過24 h pH計檢測的結果基本一致。說明，檢測鼻咽部分泌物中胃蛋白酶可以作為檢測鼻咽反流的簡便、快捷的客觀檢查方法。但是，由于正常兒童中也可能存在生理性反流，所以需要對檢測數值進行校正，以便準確地判定病理性鼻咽部反流。

腺樣體解剖位置深在，隱蔽，是胃內容物反流進入鼻腔、中耳腔必經的結構，而腺樣體表面的溝壑樣解剖特點，利于胃蛋白酶等物質的局部滯留，從而產生長期的刺激，激發慢性炎癥。腺樣體與扁桃體共同構成了上呼吸道、消化道的免疫防線[1]，腺樣體中含有各個發育階段的T淋巴細胞、B淋巴細胞、漿細胞、吞噬細胞及樹突狀細胞等細胞，當腺樣體受到病理刺激時，腺樣體樹突狀細胞、上皮細胞等細胞轉運抗原，最終會導致使T輔助細胞得以識別和活化。淋巴細胞的激活，使免疫反應增強，表現出免疫細胞的活躍[14-15]，當刺激因素長期存在時，可以使腺樣體的免疫反應長期處于一種活躍狀態，造成淋巴組織的增生，發展成為AH[15]。本研究發現AH組織中BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20均有較高的表達水平，AH組織中BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20可以從不同角度反應腺樣體組織內的免疫反應狀態，上述標記物在同時伴有扁桃體肥大的病例中有更高表達水平的趨勢，并且與AH程度密切相關。此外，本研究還發現胃蛋白酶的表達與腺樣體組織中的標記物成正相關，說明胃內容物的鼻咽部反流可能是AH的病因之一。但是，并非所有的AH患兒的鼻咽分泌物中都檢測到胃蛋白酶，提示AH可能是一種多病因、多因素引起的疾病。有研究報道部分AH患兒的腺樣體組織中檢測到了幽門螺桿菌和EBV[16-17]。所以，微生物的定殖感染也是可能的病因之一，各種致病因素間是否有協同作用仍需更進一步研究。

AH可以造成上呼吸道阻塞，為克服呼吸道阻塞的努力呼吸可以產生過大的胸腔內壓，從而加重了胃內容物反流，而胃內容物的鼻咽部反流又可以進一步刺激腺樣體增生，造成一個惡性循環[18]。本研究證實了AH與胃內容物反流的相關性，使得應用抗酸治療成為可能的保守治療方法[19]，可以作為手術之外的一種可能治療方式。Phipps等[4]報道對于合并胃食管反流的鼻竇炎患兒，進行抗反流治療可明顯減緩臨床癥狀，降低手術概率。Stapleton等[20]報道1例3歲腺樣體及扁桃體肥大伴聲門下狹窄的患兒，經質子泵抑制劑等抗反流治療后，腺樣體及扁桃體明顯萎縮，聲門下狹窄消失。本課題病例進行隨訪發現，術后6個月時5例患兒出現腺樣體的再增生，并且再增生病例的腺樣體組織中各種標記物的表達水平均高于所在亞組的平均水平，說明腺樣體切除術后殘留腺樣體組織的免疫活躍與再增生相關，提示術后的患兒上呼吸道仍存在刺激因素，殘留腺樣體組織的免疫存在代償活躍狀態。腺樣體或扁桃體切除手術治療的同時，應同時關注對上呼吸道持續存在的刺激因素的干預。所以，對于存在反流事件的AH患兒，術后抗酸治療可能成為一種預防腺樣體再生長的重要手段。有研究發現，腺樣體組織中存在高表達的白細胞介素受體[21]，在AH的治療中應用孟魯斯特取得不錯的效果[22]。但是，也有研究報道，質子泵抑制劑雖能明顯減小腺樣體的體積，但是與對照組(維生素C)無明顯差別[23]。迄今為止，仍少見大樣本量的研究來證實抗酸治療對AH的療效，仍值得進一步探討。

本課題通過檢測鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的表達，證實部分AH患兒中存在胃內容物的鼻咽部反流，而檢測鼻咽部分泌物中的胃蛋白酶可作為監測胃內容物鼻咽部反流的有效方法。此外，通過分析腺樣體組織中BCL-2、PCNA、CD45Ro、CD20的表達，說明AH患兒的腺樣體組織中存在較活躍的免疫反應，淋巴組織增生。而鼻咽部分泌物中胃蛋白酶表達水平與腺樣體的免疫反應活躍程度相關，說明胃內容物鼻咽部反流可能是AH的可能病因之一，為進一步探討AH的致病因素及術后防治提供了新的思路。

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The association between the nasopharyngeal reflux of gastric contents and the immune status of adenoid tissues*

ZhangChunlin1,LinXiaoyan2,LiChunlei1,RaoCheng1,WangKe1,3,LiuZhaohui1△

(1.DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofOtorhinolaryngology,GuangdongProvincialMaternityandChildCareCenter,Guangzhou,Guangdong510310,China;3.DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXi′anMedicalUniversity,Xi′an,Shanxi710077,China)

Objective To explore the association between nasopharyngeal reflux of gastric contents and the immune status of adenoid tissues in children with adenoid hypertrophy(AH).Methods The pediatric AH patients were collected and divided into group A(AH without tonsil hypertrophy) and group B(AH with tonsil hypertrophy),children without AH and tonsil hypertrophy were collected as control group.ELISA and immunohistochemistry were adopted to detect pepsin in nasopharyngeal secretions and BCL-2,PCNA,CD45Ro and CD20 in adenoid tissues,respectively.Then,the association between pepsin and levels of BCL-2,PCNA,CD45Ro and CD20 were analyzed.Moreover,we also explored the relationship between above biomarkers and the degree of AH.Results In group A and group B,the levels of pepsin in nasopharyngeal secretions were(2.91±1.69)ng/mL and(2.70±1.42)ng/mL,meanwhile the positive rates of pepsin in nasopharyngeal secretions were 57.1% and 54.6%,respectively,which all were significantly higher compare with the control group(P<0.01),however,no significant differences were found between group A and group B.Compared with group A,there was a tendency of higher levels of all biomarkers in group B,though only the comparison of CD20 reached the statistical significance(P=0.042).Pepsin level was positively correlated with the levels of BCL-2,PCNA,CD45Ro and CD20,the correlation coefficient were 0.638,0.661,0.634 and 0.583,respectively.Moreover,the positive rate and levels of BCL-2,PCNA,CD45Ro and CD20 were related with the adenoid hypertrophic degree(P<0.01).Conclusion Some AH patients had nasopharyngeal reflux of gastric contents,and in their adenoid tissues,an active immune status which was positively related with pepsin expression was observed.The nasopharyngeal reflux of gastric contents was a probable etiological factor of AH.

adenoid hypertrophy;gastroesophageal reflux;Nasopharyngeal reflux;Pepsin A;immunocompetence

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.013

貴州省科技廳聯合基金資助項目(黔科合J字LKZ[2012]06號)。

張春林(1984-)，副主任醫師，博士，主要從事耳鼻喉基礎與臨床研究?！?/p>

，E-mail:rcent@163.com。

R766.9

A

1671-8348(2017)06-0760-04

2016-10-23

2016-11-25)