苦味受體激動劑苦精對哮喘氣道炎癥及重塑的影響

閆 珊，程 麗，趙曉寧，黃軼民，劉 麗，劉靜靜，高福生△

(1.濰坊醫學院臨床醫學院 261053;2.濰坊醫學院附屬醫院呼吸內科 261000)

論著·基礎研究

苦味受體激動劑苦精對哮喘氣道炎癥及重塑的影響

閆 珊1，程 麗1，趙曉寧1，黃軼民1，劉 麗2，劉靜靜2，高福生2△

(1.濰坊醫學院臨床醫學院 261053;2.濰坊醫學院附屬醫院呼吸內科 261000)

目的 觀察苦精對哮喘小鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、氣道上皮下膠原纖維及氣道炎癥的影響。方法 45只BALB/c小鼠分為3組，每組15只。A組：正常對照；B組：哮喘模型組；C組：哮喘加苦精干預1周。采用免疫組織化學方法觀察小鼠肺組織α-SMA的沉積，用馬松(Masson)染色方法觀察小鼠氣道膠原纖維的沉積，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠氣道炎性程度，并對其進行計算機圖像半定量分析。結果 C組小鼠肺內細支氣管壁α-SMA、膠原纖維沉積、氣道炎癥程度較B組明顯減少，圖像半定量分析結果與B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 苦精可以改善哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑。

苦味受體；苦精；哮喘；氣道炎癥；氣道重塑

哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑為特征的慢性疾病[1]，哮喘時嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞增多，這些細胞可以分泌炎性介質，進而加重氣道阻塞、黏液分泌，最終發生氣道重塑[2]。

氣道重塑加重了哮喘患者的病死率，包括上皮下膠原纖維增生，黏液過度分泌，細胞外基質沉積，氣道平滑肌增厚等[3-4]。糖皮質激素是臨床上治療哮喘的一線用藥，可以改善氣道炎癥，減緩氣道重塑。但臨床上一些患者對糖皮質激素不敏感[5-7]，而且糖皮質激素還可以引起高脂血癥、高血糖、高血壓、骨質疏松癥等不良反應[8-9]，糖皮質激素類藥物對于哮喘的治療有一定局限性，因此找到一種新型、有效的治療哮喘的藥物很重要。

Deshpande等[10]近年發現人類肺部存在苦味受體(TAS2R)，TAS2R激活后可以引起氣道高效舒張，顯著降低哮喘患者的氣道阻力。但關于TAS2R 是否可以改善哮喘氣道重塑的研究尚未見報道。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)可反映氣道平滑肌數量及其收縮能力的改變[11]，α-SMA和膠原纖維的沉積被認為是氣道重塑的重要指標[12]。

本實驗通過制造卵清蛋白(OVA)致敏和激發的哮喘小鼠模型，用TAS2R激動劑苦精干預，探究了苦精對于哮喘氣道炎癥及氣道重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BABL/c小鼠45只，購自北京華阜康生物有限公司，6～8周齡，平均體質量16～20 g，飼養于濰坊醫學院動物房，12 h晝夜交替，標準飼料，自由取水。

1.2 主要試劑與儀器 霧化器(上海魚躍公司)，密閉霧化箱(自制，20 cm×15 cm×10 cm)，OVA、氫氧化鋁粉劑[Al(OH)3]、苦精(美國Sigma公司)，Solarbio、α-ASM、Masson染色試劑盒、HE染色試劑盒(北京Solarbio公司)。

1.3 方法

1.3.1 哮喘模型的制備給藥 45只BALB/c小鼠分為3組，每組15只。A組：正常對照組；B組：哮喘模型不干預組；C組：哮喘加苦精干預1周組。B組、C組小鼠在第1天、第15天，每只鼠腹腔注射0.2 mL[PBS配置，含100 μg OVA,1 mg Al(OH)3]OVA混懸液致敏，從第21天起，用1%OVA進行霧化，每周3次，連續8周。A、B組小鼠用等量生理鹽水做同樣處理。C組小鼠從第8周開始，每天霧化前30 min每只小鼠霧化吸入800 μg苦精(800 μg苦精溶解于5 mL PBS里)。

1.3.2 獲取肺組織 最后一次霧化后，次日麻醉小鼠，剖開胸部，心臟取血1 mL后注入1 mL 生理鹽水，以沖洗肺部紅細胞。用眼科剪剪取肺組織，放入4%多聚甲醛，4 ℃儲存備用。

1.3.3 免疫組織化學 儲存的肺組織石蠟包埋后，5 μm厚切片，一抗為抗小鼠抗體α-ASM，用PBS進行1∶200稀釋，二抗為兔抗小鼠抗體，進行α-SMA的免疫組織化學染色。用Imagepro-plus IPP測定各組肺組織α-SMA相對水平(以免疫組織化學染色靜態灰度值表示)。

1.3.4 馬松(Masson)染色及蘇木素-伊紅(HE)染色 儲存的肺組織石蠟包埋后，5 μm 厚切片，按照試劑盒操作說明進行Masson染色和HE染色，分別顯示膠原纖維的增生情況及炎癥情況。

2 結 果

2.1 各組肺組織的α-ASM免疫組織化學 α-SMA免疫組織化學半定量分析顯示，B組肺組織中α-ASM水平顯著增加，免疫組織化學染成棕黃色，苦精干預一周后，C組α-ASM水平較B組下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 各組肺組織的Masson染色 Masson染色顯示，B組小鼠氣道上皮下膠原纖維沉積增多，染色呈淡藍色，苦精干預1周后，與B組比較，C組膠原纖維減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 各組肺組織的HE染色 肺組織HE染色顯示，A組氣道黏膜光滑連續、無皺褶，氣道管壁無明顯增厚，肺泡大小一致，壁薄均無增厚；B組氣道黏膜皺褶明顯增多，氣道管壁、基底膜增厚，血管及平滑肌增生，氣道周圍可見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔不均勻增厚；C組氣道管壁、基底膜增厚，管腔狹窄及氣道周圍炎性細胞浸潤，以上病理改變均較B組減輕。見圖3。

A：A組(×200);B:B組(×200);C:C組(×200);D:定量分析圖；a:P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較。

圖1 各組肺組織的α-ASM表達(免疫組織化學)

A：正常組(×200)；B:哮喘組(×200)；C:苦精1周組(×200)；D:定量分析圖；a:P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與哮喘組比較。

圖2 各組肺組織的Masson染色

A：A組B:B組C:C組。

圖3 各組肺組織的HE染色(×200)

3 討 論

氣道重塑是哮喘的重要病理特征。氣道上皮細胞脫落，杯狀細胞增生，黏液腺過度分泌，上皮下膠原纖維增生，氣道平滑肌細胞增生肥大，氣道高反應性增加，造成哮喘患者肺功能嚴重降低[13]。

在本實驗中，筆者用OVA反復給小鼠霧化吸入，制造哮喘小鼠模型。11周后，OVA致敏和激發的小鼠出現躁動不安，搔抓、打噴嚏、呼吸急促等反應，HE染色顯示，B組小鼠模型氣道壁明顯增厚，杯狀細胞增生，Masson染色顯示B組小鼠氣道下膠原纖維沉積，說明本實驗成功制造出慢性哮喘小鼠模型。C組用苦精連續給藥1周后，與B組相比，氣道上皮下膠原纖維、氣管周圍炎性細胞、氣道α-ASM的沉積量明顯減少，說明苦精可以改善哮喘氣道的炎癥及重塑。

苦精是一種苦味受體激動劑，可以作用于氣道平滑肌上的TASZR[10]，引起氣道平滑肌細胞內鈣離子增加，而使氣道高效舒張，其舒張效果是β2受體激動劑的3倍[10]。近年發現，TASZR不僅存在于人類的味蕾中，在人體其他組織比如腎臟中，也發現了TASZR，可以發揮調節血壓的功能[14]。抗瘧藥氯喹是另一種TASZR激動劑，研究表明，苦精、氯喹均可使哮喘患者血液中TNF-α、IL-13減少[15]，而TNF-α、IL-13是與哮喘炎癥密切相關的炎性因子，IL-13還可以通過IL-4受體上調黏蛋白的表達，促使氣道上皮細胞分化為杯狀細胞，增加哮喘患者氣道黏液的分泌[16]。目前國內外仍未見關于苦味受體激動劑與哮喘氣道炎癥及重塑關系的報道，本實驗對苦精干預后的肺組織進行HE染色、Masson染色、α-ASM免疫組織化學，結果顯示苦精干預后，氣道上皮下膠原纖維減少，α-ASM水平減少，氣道周圍炎性細胞減少，證明苦精可以減少氣道的炎癥及重塑，苦味受體激動劑或許成為治療哮喘的新型藥劑，這為哮喘治療提供了新思路。

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Effect of denatonium benzoate on airway inflammation and remodeling in asthmatic mice

YanShan1,ChengLi1,ZhaoXiaoning1,HuangYimin1,LiuLi2,LiuJingjing2，GaoFusheng2△

(1.ClinicalMedicineSchool,WeifangMedicalSchool,Weifang,Shandong261053,China;2.DepartmentofRespiratury，AffiliatedHospitalofWeifangMedicalSchool,Weifang,Shandong261000,China)

Objective To evaluate the effect of denatonium benzoaten on α-smooth muscle actin (α-SMA),subepithelial collagen and airway inflammation in asthmu mice.Methods Forty-five BALB/c mice were divided into 3 groups,normal control group (A group),asthma model group (B group),asthma model+denatonium benzoaten group(C group);α-SMA detected by using immunohistochemistry,lung sections were stained with Masson to detect subepithelial collagen,HE stain method was used to observe the airway inflammation the images were analyzed with semi-quantitative computer.Results The deposition of α-SMA、subepithelial collagen and inflammation degree in C group was significantly reduced compared with B group,the difference were statistically significant(P<0.05).Conclusion Denatonium benzoaten can improve airway remodeling in asthmatic mice.

bitter taste receptor;denatonium benzoate;asthma;airway inflammation;airway remodeling

閆珊(1989-)，碩士，主要從事呼吸疾病研究。△

，E-mail:gaofs888@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.010

R562.1

A

1671-8348(2017)06-0752-03

2016-10-20

2016-11-18)