黃芪總苷液對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖凋亡的影響*

付 昱,張 良,陳 娜,嚴(yán) 志,楊 靜

(湖北省武漢市第一醫(yī)院皮膚科 430022)

論著·基礎(chǔ)研究

黃芪總苷液對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖凋亡的影響*

付 昱,張 良,陳 娜,嚴(yán) 志,楊 靜

(湖北省武漢市第一醫(yī)院皮膚科 430022)

目的 探討黃芪總苷液對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法 不同濃度黃芪總苷液(10、20、40 ng/mL)干預(yù)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖；實(shí)時(shí)(real-time)PCR 測(cè)定成纖維細(xì)胞凋亡抑制基因survivin及細(xì)胞凋亡因子p53及Bcl-2的表達(dá)；Western blot 檢測(cè)成纖維細(xì)胞survivin、p53及Bcl-2蛋白水平表達(dá)。結(jié)果 MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(不加黃芪總苷液)比較，各黃芪總苷液各濃度組細(xì)胞490 nm處吸光度(A)值明顯降低，瘢痕疙瘩細(xì)胞增殖均明顯受抑制且呈劑量依賴性 (P<0.05)。real-time PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，黃芪總苷液對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡相關(guān)因子survivin、Bcl-2有不同程度的抑制作用，對(duì)P53有不同程度的促進(jìn)作用，且呈濃度依賴性。結(jié)論 黃芪總苷液能抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，調(diào)控其凋亡，從而達(dá)到有效治療瘢痕疙瘩的效果。

黃芪總苷液；瘢痕疙瘩;成纖維細(xì)胞；survivin；p53

瘢痕疙瘩是一種常見的皮膚纖維組織增生疾病，該病理組織成纖維細(xì)胞增殖異常且膠原蛋白異常合成。黃芪總苷是從豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪中提取出來的主要有效部位[1]。近年來，黃芪的藥理作用及其機(jī)制有大量研究，學(xué)界在黃芪對(duì)增生性瘢痕的作用研究中發(fā)現(xiàn)了它對(duì)瘢痕有明顯的抑制作用[2]。因此，深入認(rèn)識(shí)黃芪總苷對(duì)人瘢痕疙瘩皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響很有必要，本研究以在抑制細(xì)胞非程序化凋亡過程中尋找新的治療方法，為瘢痕疙瘩的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)試劑盒(KAPA公司)，蛋白質(zhì)Marker(Thermo公司)，Trizol(Ambion公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩組織成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 取手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織，將表皮和皮下組織去除干凈后用少量含有15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液于37 ℃，5% CO2孵箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。取第3～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.2.2 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘢痕成纖維細(xì)胞，加入不同濃度的黃芪總苷液(10、20、40 ng/mL)，24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分別接種于96 孔板，每孔180 μL，每種細(xì)胞每塊板接種3個(gè)同樣的孔作為復(fù)孔，1×103～5×103個(gè)/孔，以100 μL培養(yǎng)液做空白對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)過夜；按分組加入不同濃度的黃芪總苷液，繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。小心吸去上清液，加入90 μL 新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清液，每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm 處測(cè)量各孔的吸光度(A)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、 Formazan 溶解液)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3 real-time PCR 細(xì)胞總 RNA 提取嚴(yán)格按 Trizol 提取液說明書進(jìn)行，按照相應(yīng)的 PCR 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA；按表1引物進(jìn)行real time-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95 ℃ 5 min；變性 95 ℃ 1 min，退火 58 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 90 s，循環(huán) 35 次；最后 72 ℃ 7 min 延伸。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 于加藥后24 h收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，以含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液分別處理細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電冰(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)膜，免疫抗體反應(yīng)，最后化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯帶。

表1 RT-PCR所用引物序列

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性 不同濃度的黃芪總苷液處理24、48、72 h后，通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A值明顯降低，瘢痕疙瘩細(xì)胞增殖均明顯受抑制，且呈劑量依賴性 (P<0.05)，見圖1。

圖1 黃芪總苷液對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的作用

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 不同濃度的黃芪總苷液處理24 h后，survivin、p53、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平與黃芪總苷液呈藥物濃度依賴性，隨著藥物濃度增高，survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，P53蛋白表達(dá)水平增高。survivin在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中高表達(dá)。見圖2。

圖2 不同濃度黃芪總苷液干預(yù)的成纖維細(xì)胞中 survivin、p53、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3 real-time PCR檢測(cè)結(jié)果 不同濃度的黃芪總苷液處理48 h后，瘢痕疙瘩細(xì)胞survivin、Bcl-2的表達(dá)水平見圖3。黃芪總苷液與survivin、p53、Bcl-2呈藥物濃度依賴性，隨著藥物濃度增高，survivin、Bcl-2基因表達(dá)水平降低,P53基因表達(dá)表水升高，與蛋白表達(dá)結(jié)果一致。

圖3 不同濃度黃芪總苷液干預(yù)的成纖維細(xì)胞中 survivin、p53、Bcl-2 mRNA表達(dá)

3 討 論

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷后增殖異常的一種特殊瘢痕[3]，是創(chuàng)面愈合后形成的良性腫瘤。目前有很多方法治療瘢痕疙瘩，但無一種方法持久有效。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，試驗(yàn)研究表明瘢痕疙瘩的病理特征是成纖維細(xì)胞的過度增殖和膠原蛋白的過度累積[4]，高表達(dá)的生長(zhǎng)因子受體[5]，成纖維細(xì)胞增生及凋亡、膠原、胞外基質(zhì)合成等生理活動(dòng)失衡。在多種發(fā)病機(jī)制中，成纖維細(xì)胞的增殖及凋亡水平失衡占重要地位，因此通過基因工程手段有目標(biāo)地針對(duì)性誘導(dǎo)改變瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡水平成為治療瘢痕疙瘩的新途徑。

survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis of protein,IAP)家族成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子之一[6]。survivin在人類腫瘤細(xì)胞系(如肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞)中高表達(dá)，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、發(fā)展、血管生成、抗治療及預(yù)后不良相關(guān)。潛在的分子機(jī)制研究表明，survivin參與了細(xì)胞質(zhì)分裂和細(xì)胞周期相關(guān)因子的調(diào)節(jié)[7]，促進(jìn)survivin的表達(dá)水平可以使YAP(Yes-associated protein)核蛋白發(fā)生累積，促使阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[8]。survivin抑制劑YM155能通過上調(diào)電壓依賴型K+通道促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡[9]。于冬梅等[10]研究發(fā)現(xiàn)瘢痕中survivin過度表達(dá)能抑制促凋2蛋白的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過程關(guān)鍵酶的異常表達(dá)。Cao等[11]前期工作發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中survivin的表達(dá)明顯高于正常皮膚，推測(cè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的survivin因子可以作為瘢痕疙瘩的潛在治療新靶點(diǎn)。survivin基因能抑制成纖維細(xì)胞的程序化死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常及惡性轉(zhuǎn)化[12]，與瘢痕疙瘩的形成有密切聯(lián)系。

細(xì)胞凋亡因子p53 是最常見的腫瘤抑制基因，能引起細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞衰老凋亡，影響癌細(xì)胞的發(fā)展[13]。p53可以作為針對(duì)乳腺癌治療的候選靶基因[14]，有超過50%的人類癌癥體細(xì)胞中p53發(fā)生了突變[15]。在一些非皮膚惡性腫瘤中，基因突變率為46.7%～95.0%，而在皮膚瘢痕腫瘤細(xì)胞中的突變率更低，但皮膚瘢痕腫瘤細(xì)胞多由于燒傷、燙傷或機(jī)械性創(chuàng)傷等損傷后細(xì)胞過度增生引起，這可能是細(xì)胞發(fā)生基因突變的誘導(dǎo)因素[16]。p53突變能通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩種體內(nèi)信號(hào)途徑來調(diào)控細(xì)胞[17]，在發(fā)生DNA損傷的情況下，p53誘導(dǎo)下游通路Bcl-2、bax等蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡[18]。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)較正常皮膚明顯增加，抑制了Cyt-C的釋放，導(dǎo)致線粒體膜通透性降低，進(jìn)而影響線粒體途徑下游凋亡信號(hào)的傳遞[19]。

黃芪有多種藥理作用，如影響代謝、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等[20]。黃芪根部植物化合物質(zhì)能保護(hù)皮膚組織免受紫外線的損傷[21]，黃芪萃取物在小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型中的研究顯示，黃芪萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞有良好的抑制作用且對(duì)動(dòng)物無明顯毒副作用[22]。黃芪多糖可以通過TLR-4調(diào)控RAW364.7細(xì)胞因子-蛋白激酶MAPKS及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)水平[23]。黃芪在腫瘤細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)具有一定的影響，因此黃芪在腫瘤中的應(yīng)用成為近期研究熱點(diǎn)。有研究顯示，黃芪對(duì)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞有較好的調(diào)節(jié)作用，而巨噬細(xì)胞增多與腫瘤患者良好預(yù)后相關(guān)，能干擾抗腫瘤免疫[24]。

本實(shí)驗(yàn)中，黃芪總苷液能明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖活性，并呈濃度依賴性。檢測(cè)凋亡抑制因子survivin、Bcl-2、促凋亡因子p53的表達(dá)水平，均與藥物濃度呈線性負(fù)相關(guān)。結(jié)合課題前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，黃芪總苷液通過經(jīng)典TGF-β/Smad 通路中過表達(dá)Smad2及抑制Smad3表達(dá)水平從而抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。確定黃芪總苷液通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡平衡狀態(tài)，為治療瘢痕疙瘩提供理論依據(jù)。

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Effects of astragaloside on proliferation and apoptosis of keloid fibroblasts*

FuYu,ZhangLiang,ChenNa,YanZhi,YangJing

(DepartmentofDermatological,FirstHospitalofWuhancity,Wuhan,Hubei430022,China)

Objective To study the effect of astragaloside on proliferation and apoptosis in human keloid fibroblasts.Methods The human keloid fibroblast cells were treated with different concentration of astragaloside(10、20、40 ng/mL).Cell proliferation was detected by MTT,the gene expreesion levels and protein levels of apoptosis-related proteins,survivin,p53 and Bcl-2,were determined by real-time PCR and Western blot,respectively.Results Comparecl with control group(treated with 0 ng/mL astragaloside), the absorbance values (A490 nm) of each concentration group were significantly reduced,which suggest that the proliferation of all keloid fibroblast were markably inhibited in a dose-dependent way (P<0.05).The gene expreesion levels and protein levels of apoptosis-related proteins,survivin、Bcl-2 were largely suppressed and P53 were largely promoted in a dose-dependent.Conclusion The keloid fibroblasts cells proliferation and apoptosis could be regulated by astragaloside.

astragaloside;keloid;fibroblasts;survivin;p53

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.008

武漢市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(WZ15Z09)。

付昱(1977-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事皮膚外科及美容學(xué)相關(guān)研究。

R285

A

1671-8348(2017)06-0746-03

2016-10-21

2016-11-19)