食管癌血紅素加氧酶-1表達水平與氟尿嘧啶療效的關系研究*

張 健，馬德華，陳保富，郭海謝，張 波，朱成楚

(溫州醫科大學附屬臺州醫院心胸外科，浙江臨海 317000 )

論著·基礎研究

食管癌血紅素加氧酶-1表達水平與氟尿嘧啶療效的關系研究*

張 健，馬德華，陳保富，郭海謝，張 波，朱成楚△

(溫州醫科大學附屬臺州醫院心胸外科，浙江臨海 317000 )

目的 本實驗旨在探討Eca109食管鱗癌細胞中血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達水平與5氟尿嘧啶(5-FU)化療敏感性的關系。方法 培養Eca109食管鱗癌細胞，應用RT-PCR及Western blot方法分別檢測不同濃度(0、20、80、100 μmol/L)ZnppⅨ處理后細胞HO-1基因及HO-1蛋白表達水平，應用噻唑藍(MTT)法檢測各實驗組細胞生長曲線及藥物抑制率。結果 隨著培養基ZnppⅨ濃度的增加，細胞抑制率顯著增高，80 μmol/L ZnppⅨ組顯著高于20 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)。各組間HO-1 mRNA的表達量依次為0.50±0.17、0.55±0.15、0.58±0.09、0.55±0.16，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組間HO-1的表達量依次為0.85±0.07、0.63±0.11、0.43±0.12、0.25±0.10，組間差異有統計學意義(F=20.01，P<0.01)。結論 Eca109食管癌細胞抑制率與ZnppⅨ濃度正相關，而ZnppⅨ不是從基因水平，而是從蛋白的表達水平抑制HO-1的表達。

食管腫瘤;血紅素加氧酶-1;氟尿嘧啶;藥物療法;耐受性

目前在世界范圍內，食管癌已成為癌癥死亡的主要原因，嚴重危害人類健康和生命[1]。這與食管癌細胞侵襲性和轉移性的生物學特征密切相關，然而對其侵襲和轉移機制的研究仍是一大難題。20世紀80年代中末期，Müller等[2]率先在動物和人體的肝、脾、肺、腦和睪丸等組織中分離獲得血紅素加氧酶(HO)及HO的同工酶。HO是體內降解血紅素重要的限速酶,其可將血紅素分解為一氧化碳、Fe2+、膽綠素。近年來相關研究還表明HO與腫瘤增殖、血管發生、凋亡、耐藥等生物學行為密切相關。本文擬研究HO-1與食管癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)化療敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌ECa109細胞購自中國科學院細胞庫，噻唑藍(MTT)購自美國Generay BioTech 公司，兔抗人、鼠HO-1單克隆抗體購自美國Epitomics公司，鋅原卟啉(ZnppⅨ)購自美國Sigma公司，5-FU(250 mg/10 mL)購自上海佳和生物科技有限公司， PT-PCR試劑盒購自美國Thermo Scientific Fermentas 公司。

1.2 實驗分組 5-FU濃度梯度分組：細胞接種6 h待其貼壁后，分別加入正常培養基，含12.5、50.0、100.0 μg/mL 5-FU的培養基，每24小時檢測1次，直至第4天；ZnppⅨ實驗分組：正常細胞接種6 h待其貼壁后，分別加入正常培養基，含20、80、100 μmol/L ZnppⅨ的培養基培養12 h，每24小時檢測1次，直至第4天。

1.3 MTT法繪制ECa109細胞生長曲線 選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值，記錄結果。以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.4 RT-PCR檢測各組細胞中HO-1 mRNA表達水平 收集各組細胞，提取總RNA，行RT-PCR檢測。HO-1基因上游引物為5′-CCA GCA ACA AAG TGC AAG ATT C-3′，下游引物為5′-GGT AAG GAA GCC AGC CAA GAG-3′，產物長度為240 bp。擴增條件為在95 ℃預變性2 min：94.0 ℃ 45 s，64.5 ℃ 90 s ，72.0 ℃ 60 s，循環30次；最后在72.0 ℃ 保溫10 min。100 V瓊脂糖凝膠電泳35 min。并用AlphaImager2200凝膠成像系統進行掃描分析。以β-actin為內參，用軟件Quantity One 行灰度值分析。

1.5 Western blot分析HO-1蛋白表達 收集各組Ecal09細胞，提取總蛋白，一抗為1∶100稀釋的HO-1，二抗為1∶200稀釋的辣根過氧化物酶標記的IgG，DAB顯色，將膠片進行掃描及拍照，用凝膠圖象處理系統分析。用Quantity one軟件對電泳結果進行灰度分析，計算HO-1/GAPDH比值，進行統計分析。

2 結 果

2.1 在不同濃度5-FU作用下的Eca109細胞生長情況 在體外細胞實驗中，隨著5-FU濃度的增加，細胞抑制率也隨之增加，兩者之間呈正相關(圖1)。在培養基5-FU濃度為100 μg/mL時，細胞培養2 d(48 h)即出現50%左右的細胞抑制率。

圖1 不同濃度5-FU作用下的Eca109細胞 生長及抑制曲線

圖2 不同濃度ZnppⅨ處理后Eca109細胞 生長及抑制曲線

2.2 不同濃度的ZnppⅨ處理后，Eca109細胞在含100 μg/mL 5-FU的培養基培養下的細胞生長情況 細胞分正常組、5-Fu組、20 μmol/L ZnppⅨ組、80 μmol/L、ZnppⅨ組。在細胞接種后的第1、2天，4組間的細胞存活情況差異無統計學意義(P>0.05)，表明ZnppⅨ對細胞無明顯毒性；于接種第2天結束，向各組細胞加入100 μg/mL 5-FU(除正常組外)，在接種第3天，正常組、5-FU組、20 μmol/L ZnppⅨ組、80 μmol/L ZnppⅨ組細胞生長情況(A值)分別為2.11±0.09,1.42±0.02,1.32±0.11,1.14±0.51，5-FU組與20 μmol/L ZnppⅨ組間差異無統計學意義(P>0.05)，80 μmol/L ZnppⅨ組顯著低于5-FU組及20 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)。在接種第4天，正常組、5-FU組、20 μmol/L ZnppⅨ組、80 μmol/L ZnppⅨ組細胞生長情況(A值)分別為2.15±0.19,1.75±0.10,1.35±0.08,0.76±0.06，80 μmol/L ZnppⅨ組顯著低于5-FU組及20 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)，見圖2。

2.3 不同濃度ZnppⅨ干預細胞HO-1基因表達情況 在正常培養基及含有20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養基培養的Eca109細胞中，各組間HO-1 mRNA 的表達量依次為0.50±0.17、0.55±0.15、0.58±0.09、0.55±0.16，組間比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖3。

2.4 Eca109細胞在不同濃度ZnppⅨ干預下HO-1蛋白表達情況 在含有正常培養基、20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養基培養的Eca109細胞中，各組間HO-1的表達量依次為0.85±0.07、0.63±0.11、0.43±0.12、0.25±0.10。各組間HO-1的表達量差異有統計學意義(F=20.01，P<0.01)，表明在蛋白水平上，ZnppⅨ能有效抑制HO-1的表達。通過兩兩之間LSD檢驗發現，HO-1的表達水平顯著高于含20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養基中的細胞HO-1的表達水平(P<0.05)。而80 μmol/L ZnppⅨ與100 μmol/L ZnppⅨ之間HO-1表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

1:正常培養；2:20 μmol/L ZnppⅨ；3:80 μmol/L ZnppⅨ；4:100 μmol/L ZnppⅨ;5、6：DNA分子標記物；7～10：β-actin。

圖3 各實驗組HO-1基因表達情況

圖4 各實驗組HO-1蛋白表達情況

3 討 論

在前期研究中，筆者發現HO-1在食管癌細胞的細胞核、細胞質及細胞膜均有表達，但在正常組織中以細胞核表達為主，而食管組織發生癌變后，食管細胞質細胞膜的表達顯著升高，細胞核的陽性率略降低，提示細胞內可能存在HO-1蛋白活化遷移。HO-1的陽性表達程度在食管癌浸潤程度(T分期)、淋巴結轉移(N分期)中均有顯著的差異性，表明HO-1在食管癌的淋巴結轉移過程中扮演重要角色[3]。HO-1在喉鱗狀細胞癌組織中過度表達[4]。敲除Nrf-2后，順鉑誘導的HO-1表達被顯著抑制，其誘導的氧化損傷顯著提高。提示抑制HO-1的表達或抑制Nrf-2，可顯著增強順鉑的抗癌效果。在肺黏液表皮樣癌中，應用miRNA抑制HO-1的表達可影響其生長及轉錄調節[5]。HO-1通過影響細胞周期及細胞凋亡作用[6]，在結直腸癌中表達上調，而且P53蛋白參與其中。在耐藥性方面，Kuroda等[7]研究表明，肺癌細胞系A549的抗順鉑耐藥性與HO-1的表達呈正相關，并與包括PI3K/AKT及NF-κB(nuclear factor-κb)信號系統在內的表皮生長因子受體介導的信號通路相關。在使用HO-1抑制劑ZnppⅨ的情況下,可增強結腸癌、肺癌和胰腺癌細胞對化療的敏感性,減慢腫瘤生長速度。Hirai等[8]應用ZnppⅨ及HO-1激動劑鈷原卟啉(CoPPIX)處理C57BL的LL/2肺癌小鼠后發現，ZnppⅨ可以有效抑制腫瘤的微血管密度并增加腫瘤細胞的凋亡率，且與劑量呈正相關，CoPPIX的作用則正好相反。HO-1在乳腺癌中過度表達[9]，除HO-1可以提高阿奇霉素對乳腺癌細胞的療效，提示HO-1可能通過阻止細胞凋亡和自噬調節乳腺癌細胞的耐藥性。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)可調節血管表皮生長因子(VEGF)的生成，而HO-1抑制劑ZnPPⅨ可抑制HIF-1α和VEGF的表達。在動物實驗中，也表明使用ZnPPⅨ后的實驗動物具有較小的腫瘤結節和較輕程度的血管生成。提示HO-1的抑制劑ZnPPⅨ具有抗腫瘤的作用，可以顯著減少HIF-1α水平，阻斷VEGF的產生從而影響腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長[10]。Ying Yang 1(YY1)是一種鋅指轉錄因子，Luo等[11]發現在食管癌組織中，YY1 mRNA表達量顯著增加，其是通過抑制HO-1的轉錄發揮生物學作用。過度表達YY1，可以增加食管癌TE1細胞的放療敏感性。本實驗針對5-FU對食管癌化療敏感性的研究顯示，在Eca109食管癌細胞接種后的第1天，4組間的細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)；在用不同濃度ZnppⅨ處理細胞后，再加入5-FU，細胞存活率呈下降趨勢。第4天時(100 μg/mL 5-FU作用2 d后)，20 μmol/L ZnppⅨ組及80 μmol/L ZnppⅨ組細胞存活率顯著低于5-FU組(P<0.05)，且20 μmol/L ZnppⅨ組細胞存活率顯著高于80 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)。提示當ZnppⅨ濃度增加，細胞內HO-1表達水平下降時，有利于增強Eca109細胞對5-FU的敏感性，使得同一濃度的5-FU取得更大的細胞抑制率。

在基因水平的研究顯示，不同濃度的ZnppⅨ處理后的Eca109食管癌細胞，其HO-1基因差異無統計學意義(P>0.05)，提示ZnppⅨ并不能從基因水平抑制HO-1的表達。但在對HO-1的基因多態性的研究中，Hu等[12]發現，飲酒組食管癌患者中L型等位基因(L/L)及L型等位基因攜帶者(S/L)的頻率顯著高于非飲酒組，且HO-1基因啟動子區-(GT)n的重復序列可能與男性飲酒者食管癌發生有關，減少飲酒量可以有效保護L型等位基因攜帶者。乙醇可以使得Eca109食管癌細胞中HO-1表達水平上調，同時伴隨著p38MAPK及mTOR通路的激活[13]。Kim等[14]從水生酸模草中提取出QC，在對食管上皮細胞的研究中表明，其可有效增高HO-1的表達，并且可能與Nrf2、ERK、PI3K-AKt及PKC信號通路有關。

在蛋白水平，在含有0、20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養基培養的Eca109細胞中，各組間HO-1的表達量依次為0.85±0.07、0.63±0.11、0.43±0.12、0.25±0.10。各組間HO-1的表達量差異有統計學意義(P<0.01)，表明在蛋白水平上，ZnppⅨ能有效抑制HO-1的表達。通過兩兩之間LSD檢驗發現，正常培養基中細胞HO-1的表達水平顯著高于含20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養基中細胞HO-1的水平(均P<0.05)。而80 μmol/L ZnppⅨ與100 μmol/L ZnppⅨ組之間HO-1表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。提示在一定范圍內(本麻驗為20～100 μmol/L )，對比正常培養的細胞，ZnppⅨ可以顯著抑制細胞HO-1蛋白的表達水平。但隨著培養基中ZnppⅨ濃度的增加(本實驗為80～100 μmol/L )，并不能進一步顯著抑制HO-1的表達水平。

正常組織細胞HO-1可起到維持細胞穩態、減低氧化損傷、削弱炎性反應的作用。而在腫瘤細胞中，HO-1的表達卻與腫瘤的擴散轉移、抗凋亡作用有密切聯系。應用HO-1抑制劑可以有效地抑制細胞生長,而應用其誘導劑則使腫瘤細胞對于產生ROS的治療方法產生抵抗效應[8]。由于HO-1具有在體內極易被快速誘導合成的優點，HO-1可作為潛在的抗腫瘤治療靶點,對與臨床抗腫瘤治療有重要意義。進一步深入探討HO-1在食管癌發生、侵襲和轉移過程中的作用，及其與各化療藥物敏感性的相關關系，探究HO-1表達水平與個體化化療間的關系有重要意義。這為通過抑制或降低HO-1表達水平，進而抑制腫瘤細胞的增殖、轉移，為臨床尋找有效的治療方案提供新思路。

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Study on HO-1 expression in hunman esophageal carcinoma and correlates with chemotherapy sensitivity of fluorouracil*

ZhangJian,MaDehua,ChenBaofu,GuoHaixie,ZhangBo,ZhuChengchu△

(DepartmentofCardio-ThoracicSurgery,TaiZhouHospitalAffiliatedtoWenzhouMedicalUniversity,TaiZhou,Zhejiang317000,China)

Objective To explore the HO-1 expression levels with 5-FU chemosensitivity in esophageal squamous cell carcinoma.Methods Eca109 cells used in all experiments,MTT assay was used in cell growth curve and inhibit rate.RT-PCR and Western blot was used to detect HO-1 in cells treated with different concentrations of ZnppⅨ(0，20，80，100 μmol/L).Results The inhibitory rate of cells was significantly increased when the concentrition of ZnppⅨ increased.The inhibitory rate of cells in 80 μmol/L ZnppⅨ was higher than 20 μmol/L ZnppⅨ group(P<0.05).The expression of HO-1 mRNA in each group was 0.50±0.17,0.55±0.15,0.58±0.09 and 0.55±0.16,respectively，there was no significant difference between the two groups (P>0.05).The expression of HO-1 was 0.85±0.07,0.63±0.11,0.43±0.12 and 0.25±0.10,respectively.The expression of HO-1 had significant difference (F=20.01,P<0.01).Conclusion Eca109 cells inhibition rate positive correlated with ZnppⅨ concentrations,and ZnppⅨ were inhibited the expression of HO - 1.not from gene level,but after the translation level.

esophageal neoplasms;heme Oxygenase-1;fluorouracil;drug therapy;tolerance

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.003

浙江省重大科技專項和優先主題項目(11C13039-2)；浙江省臺州市科技局項目(11KY11)。

張健(1987-)，主治醫師，碩士，主要從事心胸外科工作。△

，E-mail:zhucc.tzyy@gmail.com。

R735.1

A

1671-8348(2017)06-0729-03

2016-10-18

2016-11-16)