HIFU聯合載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針治療對裸鼠肝移植瘤血管生成的影響*

謝 輝，劉 山，曾 輝，李友偉，許 進，丁 雄，劉長安，李 峰△

(1.四川省德陽市人民醫院肝膽外科 618000；2.重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科 400010)

·論 著·

HIFU聯合載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針治療對裸鼠肝移植瘤血管生成的影響*

謝 輝1，劉 山1，曾 輝1，李友偉1，許 進1，丁 雄2，劉長安2，李 峰1△

(1.四川省德陽市人民醫院肝膽外科 618000；2.重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科 400010)

目的 觀察高強度聚焦超聲(HIFU)治療裸鼠肝移植瘤后，再注入載單純皰疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-TK)的納米級超聲分子探針治療效果，并探討其治療機制。方法 用人肝癌HepG2細胞構建裸鼠皮下移植瘤模型60只，采用CZF型HIFU機治療后，分別經鼠尾靜脈注射200 μL的微泡+HSV-TK+磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)(A組)、微泡+HSV-TK(B組)、HSV-TK+GPC3(C組)、HSV-TK(D組)、微泡+GPC3(E組)、PBS液 (F組)，每3天1次，共注射3次。每次注射后，根據超聲監測微泡到達靶組織的情況，對A、B、D、E組用DZC型超聲轉染儀給予2 W/cm2、1 MHz、 5 min超聲輻照。首次注射48 h后，各組經腹腔注射0.2 mL更昔洛韋(GCV，100 mg·kg-1·d-1)，連續注射14 d。治療結束后，用免疫組織化學法測殘瘤中微血管密度(MVD)水平，用Western blot和免疫組織化學法測量殘癌中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內皮生長因子(VEGF)的變化情況，用Q-PCR 檢測腫瘤中HIF-1α、VEGF基因的轉錄水平。結果 治療14 d后，B、C、D、E、F組腫瘤組織中 HIF-1α、VEGF 蛋白表達量，VEGF及HIF-1α mRNA水平，MVD均明顯高于A 組(P<0.05)。結論 載HSV-TK的納米級超聲分子探針治療可降低HIFU治療后殘瘤組織中的VEGF、HIF-1α及MVD水平，從而抑制腫瘤的生長，提高HIFU的治療效果。

血管內皮生長因子A；高強度聚焦超聲；缺氧誘導因子1；分子探針；微血管密度

高強度聚焦超聲(high-intensity focused ultrasound，HIFU)已成為手術難以切除的中晚期肝癌的一種重要治療方法。但由于各種因素的影響，HIFU治療難以完全殺滅病灶組織，因此存在治療后腫瘤的殘存和復發[1-2]。所以，研究提高和鞏固HIFU療效的方法，對于提高患者生活質量、延長生存時間具有重要意義。

隨著醫療技術的快速發展，腫瘤的基因治療逐漸成為一個新的研究熱點[3]。其中，單純皰疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韋(HSV-TK/GCV)自殺基因系統已顯示出了良好的應用前景[4]。Zhou等[5]使用超聲擊碎攜帶自殺基因的微泡，從而使自殺基因定向釋放的技術，提高了靶基因在癌細胞中的轉染效率。但是該方法是一種被動尋靶作用，缺乏主動靶向性，這有可能降低該方法的轉染效率，其療效仍有待提高。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC3)在胎兒的肝臟中高度表達，在成人正常肝組織中無表達，但肝癌發生時會再度高表達。有研究提示，在原發性肝癌中，GPC3的陽性率約為80%、特異性為90%，這表明GPC3有望成為原發性肝癌靶向治療的靶點[6-7]。本課題組前期已成功制備靶向超聲分子探針，即已完成了載基因微泡與GPC3單克隆抗體的連接。同時通過實驗證明，該方法成功地提高了自殺基因在肝癌細胞中的表達，從而靶向殺傷肝癌細胞，提高HIFU療效。本實驗旨在通過用HIFU聯合載基因納米級超聲分子探針治療裸鼠肝移植瘤，以觀察肝癌移植瘤中血管內皮生長因子(VEGF)、微血管密度(MVD)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的變化，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物 人肝癌HepG2細胞由重慶醫科大學附屬第二醫院劉長安教授贈送。SPF級BABL/C 4～6周齡雄性裸鼠共60只，體質量(20±2)g，購自重慶醫科大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑及儀器 疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、鏈霉親和素(SA)、生物素化二硬脂酰磷脂酰乙醇(Bio-DSPE)、甘油、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)購自美國Sigma公司；全氟丙烷氣體(C3F8)由重慶醫科大學超聲影像研究所惠贈；DMEM/高糖培養基購自美國HyClone公司；質粒提取試劑盒購自美國Omega公司；生物素化GPC單克隆抗體購自Abcam公司；兔抗人CD34多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人HIF-1α多克隆抗體為碧云天進口分裝；注射用GCV購自宜昌長江藥業公司，DZC型低頻超聲轉染儀由重慶醫科大學超聲影像學研究所研制。

1.3 微泡的合成、質粒的提取及載HSV-TK基因的超聲分子探針的構建 首先提取質粒。HSV-TK質粒由課題組前期構建完成，該質粒以pIRES2-EGFP為載體，用其克隆轉化大腸桿菌DH5α，經卡那霉素篩選克隆成功菌體后，在LB培養基中擴增大腸桿菌；用Omega質粒大抽試劑盒抽提、純化質粒；紫外分光光度計調整質粒純度為A260/A280=1.91，濃度為1 mg/mL。參照李奧等[8]方法合成納米級超聲微泡后，通過生物素-親和素連接法，參照景周宏等[9]方法實現GPC3單克隆抗體與微泡的結合，構建成肝癌特異性超聲分子探針，再通過靜電吸附作用，加入多聚賴氨酸連接質粒與微泡，進而制備成載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針。

1.4 HIFU治療后裸鼠移植瘤殘瘤模型的建立 取培養生長良好的HepG2細胞，用DMEM/High Glucose培養基調整細胞濃度為1×107/mL，錐蟲藍拒試驗檢測其細胞活力大于90%。取0.2 mL在裸鼠背部皮下接種，15 d后觀察見成瘤率為100%，腫瘤直徑達1.0～1.5 cm。經腹腔注射水合氯醛麻醉裸鼠后，用CZF型HIFU治療儀消融治療80%裸鼠皮下移植瘤，消融治療完成后無裸鼠死亡現象。

1.5 動物分組及處理 將HIFU治療后裸鼠分成6組，每組10只，消融后立即經鼠尾靜脈各注射200 μL(0.1 μg/μL)微泡或PBS液，微泡+HSV-TK+磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)記為A組、微泡+HSV-TK記為B組、HSV-TK+GPC3記為C組、HSV-TK記為D組、微泡+GPC3記為E組、PBS液記為F組。每3天注射1次，共注射3次。對于A、B、D、E組超聲輻照，在每次注射探針后根據超聲監測其到達腫瘤中的情況，調整超聲頻率為1 MHz、聲強為2 W/cm2進行照射，持續時間為5 min。所有裸鼠在首次輻照后48 h，經腹腔注射0.2 mL GCV(100 mg·kg-1·d-1)，連續注射14 d。

1.6 免疫組織化學檢測及判定標準 采用免疫組織化學SP法檢測各組殘瘤組織中HIF-1α和VEGF的表達及MVD。所用一抗分別為兔抗人HIF-1α和VEGF多克隆抗體(工作濃度1∶100)，及兔抗人CD34多克隆抗體(工作濃度1∶100)。結果判定標準：在細胞質或(和)細胞核內出現棕褐色和棕黃色顆粒的細胞為VEGF和HIF-1α陽性細胞，每張切片在400倍光鏡下取5個視野，用IPP圖像分析系統掃描，取5個視野積分光密度值(IOD)。MVD計數測定按照Weidner等[10]的方法：先在100倍視野下確定MVD最高區域，然后在400倍光鏡下計數微血管數目。微血管判定標準為：呈棕黃色且有管腔(管腔小于8個紅細胞大小)的內皮細胞形成的條索間隙狀結構；黃染的細胞或者細胞簇未顯示管狀結構，但與周圍的腫瘤細胞、微血管及其他結締組織分開者；管腔直徑大于8個紅細胞和可見平滑肌的管壁不計算在內。

1.7 腫瘤組織中VEGF和HIF-1α基因轉錄水平的檢測 采用Q-PCR法。治療完成后，取各殘瘤組織，用Trizol法提取液取總RNA，依步驟行熒光定量PCR。其反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環35次；72 ℃檢測信號。

1.8 Western blot檢測HIF-1α，VEGF蛋白表達 治療結束后，取各組腫瘤組織，以GAPDH為內參照，Western blot法檢測各組殘瘤組織中HIF-1α和VEGF蛋白的表達，并采用UVP凝膠圖象處理系統Labworks4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 各組殘瘤中VEGF和HIF-1α蛋白的表達 免疫組織化學和Western blot結果顯示，各組殘瘤中HIF-1α和VEGF蛋白的表達明顯高于A組(P<0.05)，同時C、D、E及F組也明顯高于B組(P<0.05)，見圖1～4。

A：A組；B:B組；C：C組；D：D組；E：E組；F：F組。

圖1 各組腫瘤組織中VEGF表達(免疫組織化學×400)

A：A組；B:B組；C：C組；D：D組；E：E組；F：F組。

圖2 各組腫瘤組織中HIF-1α表達(免疫組織化學分析×400)

a:P<0.05，與B、C、D、E、F組同指標比較；b：P<0.05，與C、D、E、F組同指標比較。

圖3 各組腫瘤組織中HIF-1α和VEGF表達的IOD

a:P<0.05，與B、C、D、E、F組同指標比較；b：P<0.05，與C、D、E、F組同指標比較。

圖4 Western blot檢測各組腫瘤中VEGF、HIF-1α的表達

A：VEGF;B:HIF-1α；a:P<0.05，與B、C、D、E、F組比較；b:P<0.05，與C、D、E、F組比較。

圖5 各組腫瘤組織中HIF-1α和VEGF基因轉錄水平

2.2 各組腫瘤組織中VEGF、HIF-1α mRNA的水平 Q-PCR結果顯示，B、C、D、E、F組殘癌組織中HIF-1α和VEGF mRNA的轉錄水平明顯高于A組(P<0.05)，同時C、D、E及F組也明顯高于B組(P<0.05)。見圖5。

2.3 各組腫瘤組織中MVD的水平 免疫組織化學結果顯示，與A組比較，其余各組腫瘤組織中MVD的水平均明顯偏高(P<0.05)，見圖6、7。

A：A組；B:B組；C：C組；D：D組；E：E組；F：F組。

圖6 各組腫瘤組織中MVD測定(免疫組織化學×400)

a:P<0.05,與B、C、D、E、F組同指標比較；b:P<0.05,與C、D、E、F組同指標比較。

圖7 各組腫瘤組織中MVD水平

3 討 論

腫瘤的生長轉移與新生毛細血管的形成密切相關，而新生血管的形成又與血管內皮生長因子、表皮生長因子等血管生成因子有關。大量研究已表明，VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的血管生成刺激因子。HIF-1是一種核轉錄因子，它由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成，主要在組織缺氧時出現。其中HIF-1α作為氧分子調節單位，對HIF-1的功能和活性起著決定性作用。大多數腫瘤組織中均存在著HIF-1α，包括早期癌變甚至癌前病變[11]，這表明腫瘤細胞缺氧發生于微血管生成之前，并對腫瘤的生長和轉化起促進作用[12]。因VEGF是HIF-1最重要的靶基因，HIF-1α也被認為是腫瘤新生血管生成的核心啟動子[13]。研究證明，HIF-1α不僅能增強VEGF的轉錄活性，還可以增加VEGF mRNA的穩定性[14-15]。Tsuzuki等[16]發現，VEGF主要表達于缺氧的腫瘤細胞內。同時，將缺失HIF-1的腫瘤細胞移植，其生成的腫瘤組織中VEGF的表達明顯降低，這再次證明了VEGF的高表達與HIF-1α的激活有關。

HSV-TK/GCV自殺基因系統是目前腫瘤基因治療的新熱點。HSV-TK基因可磷酸化無毒的GCV，將其轉化成細胞毒性藥物，從而對腫瘤細胞起殺傷作用。既往使用超聲輻照破壞攜帶目的基因的微泡，該方法提高了自殺基因在腫瘤組織中的表達，但是該方法是一種被動尋靶作用，缺乏主動靶向性。本研究采用的載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針，采用納米級微泡作為載體，同時連接上GPC3抗體，解決了傳統微泡不能主動尋靶的問題，進而提高了自殺基因的轉染率、表達率，增強了基因治療的腫瘤殺傷效應。

本實驗結果表明，HIFU治療裸鼠肝移植瘤后，再注入載HSV-TK的納米級超聲分子探針治療，在殘瘤中MVD、 VEGF及HIF-1α的表達均低于HIFU聯合包裹HSV-TK基因的超聲微泡組及其他對照組。這表明HIFU聯合載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針治療可以更有效地抑制腫瘤組織中血管的生成，使得腫瘤生長的血供條件受限，造成腫瘤內部出現缺血壞死，從而提高腫瘤的治療效果。分析其機制，可能是由于載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針，改善了腫瘤組織中的缺氧環境，進而使HIF-1α的表達降低，使得VEGF的表達下調來降低殘瘤中的MVD。但HIFU聯合載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針治療裸鼠肝移植瘤，其導致缺氧環境改善的具體機制目前尚不明確，可能與治療過程中自由基的產生有關，這有待于進一步研究。

綜上所述，HIFU聯合載HSV-TK基因的納米級超聲分子探針治療肝癌，可降低肝癌組織中VEGF和HIF-1α的表達，使腫瘤新生血管減少，破壞腫瘤生長的血供條件，進而抑制腫瘤生長、轉移，提高并鞏固了HIFU治療肝癌的療效，這為肝癌治療手段的改善提供了理論依據。

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The effect of HIFU combined with nanoscale ultrasound molecular probes with simple virus thymidine kinase gene on angiogenesis in the nude mouse tumor*

XieHui1，LiuShan1，ZengHui1，LiYouwei1，XuJin1，DingXiong2,LiuChangan2，LiFeng1△

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,People′sHospitalofDeyang,Deyang,Sichuan618000,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Objective To observe the change of the protein and gene expression of hypoxia inducing factor-1α(HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the nude mouse tumor,which has been treated by HIFU combined with nanoscale ultrasound molecular probes with HSV1-TK gene microvascular density.Methods Sixty nude mice were implanted with HepG2 Cells to establish subcutaneous transplanted tumor.Divided this mice into six groups at random after treated by HIFU:MB+HSV-TK+GPC3 (group A),MB+HSV-TK (group B),HSV-TK+GPC3 (group C),HSV-TK (group D),MB+GPC3 (group E),PBS (group F).They were injected into the tail vein every after 3 days.Mice in group A,B,D and E were exposed to ultrasound by 2 W/cm2,1 MHz,5 mintues and 0.2 mL ganciclovi(GCV) was intraperitoneally injected at the first 48 hours after injection.After the treatment,immunohistoche were used to detect the microvascular density(MVD),Western blot and immunohistoche was employed to test the protein change of the VEGF and HIF-1α,Q-PCR was used to test the mRNA gene transcription of VEGF and HIF-1α in the tumor tissues.Results After 14 days,the protein expression of HIF-1α and VEGF in group A was significantly lower than that in group B,C,D,E and F (P<0.05),the MVD level in the tumor is also like this,and the difference is statistically significant.Conclusion Anoscale ultrasound molecular probes with HSV1-TK can reduce the the level of VEGF,MVD and HIF-1α in the tumor which has been treated by HIFU,so it can inhibit tumor growth and improve the therapeutic efficacy after HIFU treatment.

vascular endothelial growth factor A;high-intensity focused ultrasound;hypoxia-inducible factor 1;molecular probe;microvascular density

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.002

國家自然科學基金資助項目(81272570)。

謝輝(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事肝硬化，膽道結石等肝膽疾病的臨床診治和研究?！?/p>

，E-mail:1340482261@qq.com。

R735.7

A

1671-8348(2017)06-0725-04

2016-10-23

2016-11-16)