單磷酸腺苷活化蛋白激酶調控細胞自噬的機制研究進展

桂迪，黃曉穎，王良興

（1．溫州醫科大學 第一臨床醫學院，浙江 溫州 325035；2．溫州醫科大學附屬第一醫院 呼吸內科，浙江 溫州 325015）

?綜 述?

單磷酸腺苷活化蛋白激酶調控細胞自噬的機制研究進展

桂迪1，黃曉穎2，王良興2

（1．溫州醫科大學 第一臨床醫學院，浙江 溫州 325035；2．溫州醫科大學附屬第一醫院 呼吸內科，浙江 溫州 325015）

自噬是細胞對外界環境應激所作出的反應，是細胞降解自身成分以維持細胞活性和生存的過程。在動物組織中，自噬機制的缺陷通常和細胞衰老、年齡相關性退化性疾病有關聯，這些疾病包括心血管疾病、癌癥、免疫系統功能受損和神經系統病變等。目前已經發現，許多蛋白可以對能量、營養和生長因子水平以及應激做出反應，其中包括一些激酶，它們可以正向或負向調節自噬過程以調節細胞對外界環境的適應性。最近研究表明細胞可以通過單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）對上述適應反應發揮重要作用，本文就近些年有關AMPK對自噬調控機制的研究成果作一綜述。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；ULK1；自噬；綜述文獻

自噬是細胞通過溶酶體途徑來降解自身成分的過程[1]，胞內待降解的蛋白復合物、受損的細胞器以及入侵的病原體等被自噬囊泡包裹并運送到溶酶體，進而被降解以維持細胞的自我穩態[2]。YORIMITSU等[3]研究發現，在哺乳動物細胞中共存在3種形式的自噬，分別是大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬。而這3種不同的自噬途徑最終都通過溶酶體體系對細胞內成分進行蛋白水解。同時，自噬也是一個緊密調控的過程，自噬缺陷和很多人類疾病相關，包括腫瘤、心肌病和神經系統退行性疾病等[5-7]。自噬在所有細胞中均處于較低的水平，有利于維持細胞的平衡狀態[4]。早期對自噬相關基因及其機制的研究大都來自酵母菌基因實驗[8]，隨后也對高等真核生物進行了研究，并命名了相應的真核生物自噬相關基因[9-10]。大量研究提示單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）可以通過不同的通路調節哺乳動物的自噬過程[11-14]，因此，進一步闡明其對自噬調控的作用，有可能為自噬相關性疾病的治療提供新思路。

1 自噬的起始調控元件

在自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）中，ATG1在自噬的起始調控中發揮著關鍵性的作用，它可以和ATG13、ATG17形成復合物，然而雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin，TOR）對ATG13的磷酸化調控可以抑制其與ATG1的結合進而阻斷上述復合物的形成[19-23]。哺乳動物中有與ATG1類似的同類物，包括ULK1和ULK2[24-25]，不同的是ULK1與ATG13則始終聯系在一起的，并且ULK1才是哺乳動物自噬起始的關鍵調控單元[14]。

2 AMPK的結構

AMPK是一種異源三聚體蛋白的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其包括1個催化亞單位α與2個調節亞單位β和γ[15-16]，其中α亞單位又分為α1和α2亞型，β亞單位包括β1和β2亞型，γ亞單位包括γ1、γ2和γ3亞型。α亞單位在N端含有絲/蘇氨酸的結構域，是其主要的催化部位，而C端則為與另外2個亞單位的結合位點[17]。激活的AMPK可以刺激產能的分解代謝途徑并抑制耗能的合成代謝過程，進而在能量代謝平衡的調節上起到關鍵性的作用[15-16]。

3 AMPK對自噬信號的調節

目前的研究提示AMPK可以對自噬的起始進行調控，在AMPK對ULK1的調控機制中，不同的研究有著不同的觀點，包括作用位點的不同以及其對ULK1是正向抑制或是負向的調控作用。同時，AMPK除了可以通過ULK1對自噬產生調控外，也可以通過哺乳動物TOR（mTOR）、細胞周期蛋白依賴激酶抑制物P27對自噬產生調控作用，其中對mTOR的調控可以間接通過磷酸化ULK1相應位點而起到對自噬的調節作用，以下將對各條通路機制進行總結。

3.1 AMPK通過直接作用于自噬相關蛋白ULK1參與自噬的調節 AMPK可以直接作用于自噬起始調控單元，在KIM等[12]的研究中，他們以細胞為實驗對象研究AMPK在ULK1的磷酸化位點，通過對ULK1的不同位點進行點突變的方法，共檢測了ULK1的蘇氨酸（Threonine，Thr）624、絲氨酸（Serine，Ser）494、Ser555、Ser574、Ser622、Ser693、Ser811、Ser317和Ser777共9個位點，最終發現在ULK1絲/蘇氨酸富集區的Ser317和Ser777 2個位點是AMPK對其主要的磷酸化位點。若同時突變這2個位點，可以明顯減少離體狀態下AMPK對ULK1的磷酸化，而突變其余的7個磷酸化位點則ULK1的磷酸化不受影響。更進一步，當細胞處于饑餓狀態時，AMPK可以通過直接磷酸化ULK1進而促進自噬的發生，而AMPK的抑制劑compoud C則可以抑制此狀態下細胞的ULK1位點的磷酸化。同時，在對AMPKα1和α2雙基因敲除的細胞檢測中也發現，與未敲除基因的細胞相比，前者ULK1的Ser317和Ser777位點磷酸化明顯減少。

與前者的磷酸化位點不同的是，在EGAN等[11]的研究中，通過檢索真核生物蛋白數據庫發現ULK1為AMPK的磷酸化作用蛋白之一，其中共篩選出4個可以和AMPK匹配的作用位點，分別是Ser467、Ser555、Ser637、Thr574。進一步的實驗研究表明，在細胞水平，AMPK可以通過以上4個位點直接磷酸化ULK1。通過質譜分析研究發現在體情況下AMPK僅通過Ser555、Ser637以及Thr574 3個位點直接作用于UKL1。

除了磷酸化位點的不同，也有研究表明AMPK對ULK1的作用可能不僅僅是簡單的激活作用。SHANG等[14]研究指出，應用細胞培養條件下穩定同位素標記技術（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）標記細胞后，在饑餓的細胞中，ULK1的Ser638、Ser758位點的磷酸化減少了10倍以上。進一步深入研究發現Ser638位點同時受AMPK和mTOR的調控，前者為去磷酸化作用，而后者為磷酸化作用，Ser758位點則單由mTOR的磷酸化作用調控。然而AMPK亞單元（AMPKα和AMPKγ1）可在營養充足的狀態下與ULK1相結合，與AMPK結合后，ULK1啟動自噬作用就會明顯減弱，此外mTOR對ULK1的Ser758位點的磷酸化作用可進一步加強AMPK與ULK1的結合，進而抑制自噬作用的發生。因而可能AMPK在自噬調控中存在著雙重作用，當細胞處于饑餓狀態時，AMPK可以促進自噬的發生，但當細胞在營養狀態豐富的情況下，AMPK則可以抑制細胞自噬的發生。

3.2 AMPK通過作用于mTOR參與自噬的調節 TOR是能量（包括氨基酸、ATP等）和激素的感受器[29]，在細胞生長調控中起著非常重要的作用，同時也是自噬過程的重要門控基因。在哺乳動物細胞中，核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，p70S6）可發揮強烈的自噬抑制作用，而mTOR激酶則可調節其活性大小[30]。同時，mTOR可以通過其他多條通路對自噬產生抑制作用:①轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）是溶酶體生成的主要調控者，而mTOR復合物1（mTOR complex 1，mTORC1）可以通過負性調控TFEB使溶酶體的生成減少，進而損傷自噬的進程[31]；②mTORC2可以通過絲/蘇氨酸蛋白激酶B（AKT）通路來下調AMPK，從而激活mTORC1-S6[32]，另外，在饑餓狀態的骨骼肌細胞中，阻斷mTORC2可以誘導細胞的自噬[33-34]；③mTOR可以直接磷酸化ULK1的Ser757位點，使AMPK磷酸化ULK1減少[12]，同時使AMPK與ULK1相結合，抑制自噬的發生[14]；④在對酵母的研究中發現，自噬過程的產生需要ATG13與ATG1的結合，然而TOR通路可以磷酸化ATG13，使其與ATG1的親和力明顯減低，進而抑制自噬[21]。

然而，AMPK可以通過2條通路對mTOR進行調控，從而促進自噬的發生。INOKI等[28]研究發現，當細胞處于饑餓狀態下時，激活的AMPK可以直接磷酸化結節性硬化癥相關蛋白2（tuberous sclerosis proteins 2，TSC2）的Thr1277和Ser1345位點，進而抑制mTOR的活性。通過RNA干擾技術敲低細胞的TSC2蛋白的表達，則可以消除由于能量不足而被誘導的S6K的去磷酸化。

GWINN等[26]研究發現，在小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中，AMPK激活劑AICAR和苯乙雙胍可以通過TSC2快速地抑制mTORC1的活性，然而即使是在TSC 2-/-的MEFs中，mTORC1的活性仍然可以被上述2種藥物有效地抑制，這提示存在AMPK的其他下游通路可以直接或者間接的調節mTORC1的活性。隨后進一步實驗提示，AMPK可以直接磷酸化mTOR調控相關蛋白（regulatoryassociated protein of mTOR，raptor）的Ser722和Ser792 2個Ser位點，從而抑制mTORC1的活性。當把這2個Ser位點進行基因沉默后，發現兩者均可以防止AMPK激動劑對mTORC1的活性抑制作用。同時NOJIMA等[27]的研究表明，raptor可以與真核細胞始動因子（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1）、核糖體S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase 1，P70S6K1）在其各自的保守TOR信號（conserved TOR signaling，TOS）區域結合進而激活mTORC1的活性，使信號通路下傳。上述研究結果提示，AMPK對raptor的磷酸化調控可能影響了raptor的此作用途徑，進而導致mTORC1活性下降。

3.3 AMPK通過作用于細胞周期蛋白依賴激酶抑制物P27參與自噬的調節 在相關研究中，研究者以人乳腺癌細胞系（michigan cancer foundation-7，MCF-7）為研究對象，發現AMPK激動劑AICAR可以通過肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）-AMPK通路磷酸化P27 Thr198位點進而提高其穩定性，以誘導自噬產生，使細胞在生長因素缺乏及代謝壓力下通過自噬而得以存活[18]。P27在自噬和細胞生存中所起的作用可能依賴于其阻止細胞周期蛋白-細胞周期蛋白依賴性激酶的作用。

4 小結

AMPK最初被認為在細胞的代謝中起著關鍵性的作用，隨著研究的不斷進展，發現AMPK的作用遠不止于此，目前發現其在自噬方面也起著重要的作用，AMPK可以通過作用于ULK1的不同的絲/蘇氨酸位點使其發生磷酸化進而促進自噬的發生，同時在營養充足的狀態下其可以結合ULK1而抑制自噬的發生。另外，AMPK可以通過直接影響mTOR及細胞周期蛋白依賴激酶抑制物P27進而調控自噬。但目前在ULK1絲/蘇氨酸區域的作用位點方面，發現不同研究中存在著明顯差異，進一步闡明差異的原因，如由于細胞類型、處理方式、刺激時間和強度的不同而致使其作用位點的不同，或是同一細胞中各個位點均有涉及，只是其中一個位點占主導地位等，可以為自噬缺陷相關疾病的防治提供依據、手段以及新的思路，值得我們進一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

R445.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.016

2016-02-26

國家自然科學基金資助項目（81473406）；浙江省衛生廳平臺計劃研究重點資助項目（2012ZDA033）。

桂迪（1985-），男，浙江慈溪人，碩士生。

黃曉穎，主任醫師，副教授，Email:zjwzhxy@126. com。